测定血管性血友病因子活性的方法及检测试剂盒的制作方法
【专利说明】
[0001] 本发明是申请日2008年7月3日、发明名称为"在不存在瑞斯托霉素的情 况下测定血管性血友病因子活性的方法和测定ADAMTS-13蛋白酶的方法"、申请号为 200880023579. 6的申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明属于凝血诊断技术领域，涉及一种在样本中测定血管性血友病因子（VWF) 活性的体外方法。所述方法包括对GPIba蛋白功能获得性变异体的使用，这样就可不使用 瑞斯托霉素、美洲矛头腹毒蛋白或与瑞斯托霉素或美洲矛头腹毒蛋白等效的其他物质。本 发明还涉及一种测定血管性血友病因子（VWF)裂解ADAMTS-13蛋白酶活性的方法。
【背景技术】
[0003] 血管性血友病因子（VWF)是血浆中的一种大分子多聚体糖蛋白，在初期止血过 程中具有重要作用。另外，VWF具有胶原蛋白结合位点和用于定位于血小板表面的糖蛋白 Ib(GPIb)的结合位点。GPIb是一种整合膜蛋白，会与另一种整合膜蛋白（糖蛋白IX(GPIX)) 在血小板膜中形成糖蛋白Ib-IX受体复合物。GPIb是双链分子，由一条表观分子质量约为 145kDa的重链（同义词：heavy chain、a链或GPIb a )和一条表观分子质量约为22kDa 的轻链（同义词：light chain、|3链或GPIb|3 )构成，这两条链通过二硫键彼此相连 [Lopez, J. A?等人（1987)Cloning of the a chain of human platelet glycoprotein Ib:A transmembrane protein with homology to leucine-rich a 2-glycoprotein. Proc.Natl. Acad. Sci USA 84:5615-5619]。
[0004] 血管受伤时，VWF结合到暴露的胶原蛋白表面。由于与胶原蛋白结合以及受到增 大的剪力（作用在与胶原蛋白结合的VWF上）的影响，VWF发生变化或被激活，从而可以结 合到血小板膜的GPIb-IX受体复合物中的GPIb重链（GPIba)的氨基末端。经激活的VWF 通过这种方式俘获从旁边经过的血小板，使得受伤处形成由VWF、胶原蛋白和血小板构成的 第一团聚体。随后血小板被激活，从而开始血浆凝血过程，该过程在经过复数次放大级联反 应和血小板进一步聚集后最终促成伤口的愈合。
[0005] VWF在质或量上的异常是血管性血友病（同义词：von Willebrand Disease，VWD) 的起因，这种病是最常见的遗传出血性疾病之一。就血管性血友病的诊断而言目前存在不 同的筛查方法，例如测定出血时间（BT)、测定VWF抗原浓度（VWF:Ag)的定量法（例如ELISA 方法）和测定VWF活性的方法（例如瑞斯托霉素诱导血小板凝集（VWF:RCo))。
[0006] 瑞斯托霉素诱导固定血小板聚集的方法（又称"瑞斯托霉素辅因子检测"）还能 识别VWF蛋白用测定VWF抗原浓度的定量法所识别不到的功能性缺陷。因此，为能对血管 性血友病做出完全诊断，有必要实施用于测定瑞斯托霉素辅因子活性的瑞斯托霉素辅因子 检测。实施瑞斯托霉素辅因子检测时通常是将患者的血浆样本与固定的血小板混合和与瑞 斯托霉素混合。在斯托霉素的诱导下，样本所含的VWF结合到所添加的血小板的GPIb受体 上，从而实现血小板的聚集。这一聚集反应的反应程度与患者样本所含的被激活的VWF的 量有关。例如，这种聚集反应可通过测量传播增长进行光学检测，从而实现VWF:RCo活性的 量化。
[0007] 与VWF抗原检测相比，瑞斯托霉素辅因子检测的优点在于可对VWF进行活性测定， 从而实现对VWF功能性紊乱的识别，以及对血管性血友病的不同子类进行分类，这些子类 中仅部分子类也是随VWF抗原浓度的降低而出现。一般情况下，对这些子类进行分类时须 形成VWF瑞斯托霉素辅因子活性（VWF:RCo)与VWF抗原浓度（VWF:Ag)的比率（Ratio)。对 于血管性血友病的子类2A、2B和2M而言，VWF:RCo/VWF:Ag之比通常小于1。通常建议将 〇. 7的比率作为极限值。
[0008] 传统的瑞斯托霉素辅因子检测的不足之处在于实施过程很难自动化，因为在测量 过程中需要不断地充分搅拌检测标本（Testansatz)中的血小板。此外，这种检测的精确度 相对较低，对相关标准所规定的处于〇%至20%范围内的低VWF活性的测定无法充分发挥 作用。
[0009] 近来有人研发出了基于GPIba的VWF-ELISA检测，这种检测所使用的重组GPIba 片段（1-289 或 1-290)包含氨基末端 VWF 结合区[W001/02853A2 或 Vanhoorelbeke, K.等 人(2002)A reliable von ffillebrand factor:Ristocetin cofactor enzyme-linked immunosorbent assay to differentiate between type land type 2von ffillebrand disease. Semin Thromb Hemost. 28 (2):161-165 以及 Federici, A. B?等人（2004)A sensitive ristocetin co-factor activity assay with recombinant glycoprotein lb a for the diagnosis of patients with low von ffillebrand factor levels. Heamatologica 89(1):77_85]。这些检测方法借助特异性抗体将重组GPIba片段结合在 酶标板上。添加患者样本和瑞斯托霉素，使得患者样本中的VWF可以结合到重组GPIba片 段上。最后借助抗VWF抗体对结合的VWF进行定量检测。结果表明，这种VWF-ELISA检测 十分接近于基于血小板的传统VWF瑞斯托霉素辅因子活性检测，甚至比之更敏感、更精确。
[0010] Hui等人（摘要，ISTH 2007)所描述的基于GPIb a的VWF-ELISA检测使用在位 置233和位置239上具有突变体的重组GPIba片段（1-483)。这些突变体是所谓的功能 获得性突变体，它们在瑞斯托霉素浓度较低的情况下与野生型GPIba蛋白（W0 93/16712) 相比对VWF的亲和性更高，可以更强烈地与VWF相互作用。上述突变体是众所周知的 GPIba链突变变异体。Miller等人（US 5, 317, 097)描述的是GPIba链的位置233上 的甘氨酸残基被缬氨酸残基（G233V)取代的方法。这种变异是血小板型血管性血友病 (PT-VWD)的起因，PT-VWD是一种常染色体显性遗传出血性疾病。Russell和Roth描述的 是GPIba链的位置239上的甲硫氨酸残基被缬氨酸残基（M239V)取代的方法[Russell，S. D. &Roth, G. J. (1993)Pseudo-von ffillebrand Disease:A mutation in the platelet glycoprotein lb a gene associated with a hyperactive surface receptor.Blood 81 (7), 1787-1791]。这种变异也会引发PT-VWD。
[0011] 上述基于GPIba的VWF-ELISA检测以及瑞斯托霉素辅因子检测的缺点在于，它们 建立在使用瑞斯托霉素或其他可以促使VWF结合到GPIb a链上的外源非生理性调节因子 的基础上。瑞斯托霉素是一种来自于诺卡氏菌属的抗生糖肽，美洲矛头腹毒蛋白（同义词： 副凝集素（co-agglutinin))是一种来自于矛头腹属的蛇毒，它们通常用于体外诱导VWF结 合到血小板或结合到分离GPIba蛋白或其片段上。使用瑞斯托霉素的缺点是，它不仅会结 合到VWF上，还会结合到许多其他类型的蛋白上，例如纤维蛋白原或抗GPIba抗体（在特 定的实验中观察到的）。因此，在VWF检测方法中使用瑞斯托霉素存在发生非特异性结合反 应或沉淀反应的风险，这些反应会使检测结果失真。
【发明内容】
[0012] 因此，本发明的目的是提供一种在不存在瑞斯托霉素的情况下测定VWF活性的方 法。
[0013] 基于人类GPIba受体氨基酸序列，通过位置233和位置239上具有两处点突变的 GPIba链的功能获得性变异体来实现本发明的目的。在本发明范围内，GPIba链的功能获 得性变异体指的是一种在瑞斯托霉素浓度较低的情况下与野生型GPIb a蛋白相比对VWF 的亲和性明显更高、可以更强烈地与VWF相互作用的突变变异体。
[0014] 本发明的标的是一种在样本中测定血管性血友病因子（VWF)活性的方法，其中， 将所述样本和分离GPIb a蛋白混合成一检测标本，该检测标本中不添加瑞斯托霉素和美 洲矛头腹毒蛋白。所用的GPIb a蛋白包括一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与人类GPIb a 蛋白的野生型序列相比至少包含氨基酸残基1-268,且分别在位置233和239上具有一种取 代基Xaa(SEQID NO:l)。GPIba链位置233上的甘氨酸残基取代基Xaa和位置239上的甲 硫氨酸残基取代基Xaa优选由一种缬氨酸残基（G233V或M239V)或一种丝氨酸残基（G233S 或M239S)构成。这两个位置上的不同取代基Xaa可以为任意一种组合。在对本发明进行 说明时，提及GPIb a蛋白时均可理解是指这样一种突变变异体。
[0015] 此外，优选不在所述检测标本中添加"瑞斯托霉素或美洲矛头腹毒蛋白的等效物 质"。在本发明范围内，"瑞斯托霉素或美洲矛头腹毒蛋白的等效物质"是指可以体外诱导分 离VWF结合到野生型GPIb a链或其片段上的外源（即非生理性）物质。
[0016] 本发明的一个优点在于，通过使用GPIba的功能获得性变异体，就无需通过（例 如）流体流动、搅拌或振动来对检测标本施加抗剪应力。
[0017] 就VWF活性测定方法而言，"样本"指的是有可能含有待检测物质（即VWF)的材 料。例如，"样本"这一概念包括特别是人和动物的生物液体（如血液、血浆或血清）以及 用于血管性血友病患者替代疗法的工业产品（如Haemate?P)，如VWF定标剂、VWF质控 血浆（VWF-Kontrolle)或高浓度VWF浓缩物。必要时须对样本进行预处理，以便可以检测 到被分析物或将干扰性的样本成分移除。这种样本预处理可以包括分离和/或溶解细胞或 对样本的离心分离。"样本"这一概念还包括包含上述样本材料中的一种样本材料的反应混 合物，该样本材料中被加入用作基质的分离VWF，以便测定VWF改性因子的活性，在培养VWF 基质后需要借助VWF改性因子在这类反应混合物中测定残留VWF活性。例如，由血浆样本 和分离大分子VWF构成的用于测定该血浆样本中的VWF裂解ADAMTS-13蛋白酶的混合物就 是这样一种反应混合物。血浆样本中的ADAMTS-13蛋白酶裂解所添加的VWF基质，从而降 低该样本的VWF活性。
[0018] 本发明的方法所用的GPIb a链可以是用重组法或合成法制成的GPIb a蛋白。已 知的原核或真核表达系统适合用来制造重组GPIba蛋白，例如在细菌（如大肠杆菌）中表 达，在酵母（如酿酒酵母、甲醇酵母）中表达，在植物、动物或人类细胞培养中表达。已知的 体外蛋白合成技术适合用来制造合成GPIb a蛋白，例如固相合成（例如Merrifield合成 法）。本发明的方法所用的GPIba蛋白优选是一种用重组法在人类细胞培养物（优选人胚 肾细胞（HEK细胞）培养物）中制成的GPIb a蛋白。
[0019] 本发明的方法所用的GPIba蛋白可在N端上与同源的人类GPIba信号序列 MPLLLLLLLLPSPLHP(SEQ ID NO:2,亦称"氨基酸残基16至1"）融合。作为替代方案，所用 的GPIb a蛋白可在N端上与异源信号序列融合，即与一种通常不存在于人类GPIb a多肽 中、但在所选表达系统中会对重组表达的GPIb a蛋白的表达和/或分泌产生有利影响的多 肽融合。例如，MPLQLLLLLILLGPGNSLQLWDTWADEAEKALGPLLARDRR(SEQ