一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测he4的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法。
【背景技术】
[0002]目前市场上对HE4蛋白的免疫学检测方法主要包括酶联免疫分析法、电化学发光法和化学发光酶免疫测定法等。酶联免疫分析法可用于定量检测，但操作步骤繁琐，受人为因素影响大，在灵敏度、特异性和应用范围上差别很大；电化学发光法定量检测的准确度较高，水平具有定量和稳定的优点，但是不适合于现代自动免疫仪器，需要专门的配套仪器使用，投资成本较高、因此难以推广应用；化学发光酶免疫测定法灵敏度和准确性要普遍高于酶联免疫法，同时对检测仪器设备的要求又远低于电化学发光法，所以一直受到广泛关注，但由于该类化学发光物质需要相应酶类进行催化发光，导致背景高灵敏度略低，此外酶催化的化学发光达到平台期需要一定时间，限制了检测效率。
[0003]化学发光免疫分析技术，是一项集中了多种免疫标记检测技术优点的免疫学检测技术，于1977年由Halmann等在经典放射性免疫分析技术的基础上创立而来。该检测技术包括两个主要系统，其中在继承了抗原抗体高特异性免疫反应系统的基础上，结合了化学发光系统，以化学发光物质作为标记物直接标记抗体或抗原，或是以能催化化学发光物质的酶作为标记物，在免疫反应后，化学发光物质在相应的氧化剂或催化酶存在的环境下，形成不稳定的中间体激发态，在回到基态时迅速释放可被化学发光仪检测到的光子信号，实现对待测抗原抗体复合物的准确定性或定量测定。其中以化学发光物质吖啶酯直接作为标记物，具有比酶催化化学发光更高的信号值和检测灵敏度。
[0004]传统的化学发光免疫分析大多以微孔板作为固相载体连接抗原或抗体，吖啶酯快速集中的发光特性使免疫分析过程更易实现自动化，便对固相载体有进一步要求。磁性微粒作为更加高效的抗原、抗体免疫反应固相载体，是一种在外磁场存在的条件下具有响应性的磁性金属或金属氧化物，大多以氧化铁为核心，经过分子修饰可以在其表面固定大量生物分子。此外磁性微粒的超顺磁性使其在外加磁场存在的情况下能够迅速聚集，而去掉外磁场后又能够重新悬浮分散于溶液中，极大缩短免疫检测操作过程中的清洗时间。
[0005]胶体金是一种具有一定大小，由静电作用形成的稳定胶体状态的金颗粒，很早就被用于生物分子的标记和检测。
[0006]结合磁性纳米粒子的超顺磁性和胶体金表面生物分子可修饰性的双重特质，发明人所在研宄组研制了 Fe3O4Au磁性复合微粒，即金磁微粒，并将其实现了商业化。金磁微粒是一种新型磁性无机物复合微粒，这种材料兼有磁性粒子在外磁场中的可分离性以及磁颗粒表面修饰后对生物分子的快速固定化等特点，在生物与医学领域具有重要的应用前景。
[0007]基于磁性微粒的化学发光免疫分析法是将磁分离技术、免疫分析技术及化学发光检测技术三者有效结合在一起的新型的分析检测技术，因而具有化学发光的高灵敏度、免疫分析的强特异性、磁分离系统的快速分离的特点，此外，还具有检测时间短、线性范围宽、以及易实现自动化等优点，因此，近年来被广泛应用于临床诊断、生物医学、食品安全及毒品检测等众多方面。
[0008]对于特定的检测对象，基于磁性微粒(包括金磁微粒)的(吖啶酯化学发光)免疫分析法的建立需要进行大量的实验和分析研宄才有可能取得有意义的成果。这主要是因为不同检测对象的分子结构、分子量、生物活性以及稳定的保存环境等都不相同。建立该方法的难点和复杂之处在于，不同检测对象对检测方法、免疫反应条件、甚至检测体系中的各个成分配比、发光液成分等都有着不同的要求，通过大量实验确定最优的结果才能达到最佳检测范围和灵敏度；在磁性分离过程中不同磁场强度或磁分离时间都直接影响分离效果；此外在抗体标记过程中，不同抗体甚至不同抗体用量，都直接影响标记体系结果的好坏(主要体现在标记效率)，标记反应条件、纯化收集的条件、保存条件等都需要反复设计实验来确定。
【发明内容】
[0009]本发明提供了一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法，以解决上述【背景技术】检测HE4存在的局限性、特异性、灵敏性、危险性等问题。
[0010]为实现上述发明目的，本发明给出以下解决方案:
[0011]基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法，包括以下步骤:
[0012]⑴包被
[0013]以金磁微粒作为免疫反应和固相分离的载体，将HE4包被抗体偶联在金磁微粒的表面；具体过程如下:
[0014](1.1)预处理:取金磁微粒，用平衡缓冲液清洗平衡I?3遍；
[0015](1.2)偶联:将HE4包被抗体与偶联缓冲液混合，将所得混合液加入经过预处理的金磁微粒中，置于摇床，在25-40°C，150?250rpm条件下充分反应，反应完后，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清；
[0016](1.3)清洗:用清洗缓冲液清洗3-5次，磁性分离，弃上清；
[0017](2)封闭
[0018]在步骤⑴的产物中加入封闭液，置于摇床中，在25_40°C条件下，以150?250rpm的转速反应I?2小时，封闭金磁微粒表面未与HE4包被抗体结合的空白位点；然后磁性分离，弃上清，用清洗缓冲液清洗后悬于保存缓冲液中保存备用；
[0019](3)抗体的标记
[0020](3.1)预处理:用洗脱缓冲液对脱盐柱进行平衡；
[0021 ] (3.2)抗体标记:取吖啶酯溶液和HE4标记抗体溶液，在标记缓冲液环境中进行标记反应，最后加入赖氨酸盐溶液再次进行反应；
[0022](3.3)纯化收集:将步骤(3.2)反应得到的抗体溶液上样脱盐柱，用洗脱缓冲液进行洗脱收集，通过收集物的发光值和抗体浓度筛选抗体纯化产物，即标记有吖啶酯的HE4抗体；
[0023](4)与待测物结合
[0024]将待检样品和能与HE4抗原发生特异性结合的标记有吖啶酯的HE4抗体，加入经过步骤(2)封闭后的结合有HE4包被抗体的金磁微粒中进行反应，待测样品中所含的HE4抗原被金磁微粒上的HE4包被抗体捕获，同时与吖啶醋标记HE4抗体结合，形成“双抗体夹心复合物”;
[0025](5)清洗
[0026]用清洗缓冲液清洗双抗体夹心复合物，磁性分离，弃上清；
[0027](6)化学发光检测
[0028]向经过步骤(5)处理后形成的双抗体夹心复合物中加入化学发光底物液，在化学发光底物液加入后立即测定待测各孔的发光强度；发光强度与待测样本的浓度成正比关系O
[0029]本发明还确立了以下优化环节和参数:
[0030]步骤(1.1)平衡缓冲液的较佳选择为以下缓冲液中的任一种:
[0031]ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0032]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液、
[0033]步骤(1.2)偶联缓冲液选自以下缓冲液中的任一种:
[0034]ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0035]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；
[0036]步骤(1.3)中采用的清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或含0.05-0.2% (体积分数，下同)吐温的该种缓冲液:
[0037]ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0038]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；
[0039]步骤(2)中采用的清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或含0.05-0.2%吐温的该种缓冲液:
[0040]ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0041]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；
[0042]步骤(2)所述封闭液为牛血清白蛋白、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶或动物血清之中的任一种或其中2-3种的混合物，该封闭液的质量体积浓度(g/mL)为1-5% ;所述动物血清为胎牛血清或马血清，封闭剂配置缓冲溶液为偶联缓冲液；
[0043]所述封闭剂配置缓冲液选自以下缓冲液中的任一种:
[0044]ρΗ5.0?8.0，