浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0045]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；
[0046]步骤⑵中采用的保存缓冲液选自以下缓冲液中的任一种:
[0047]ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0048]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；
[0049]步骤(3)中采用的洗脱缓冲液选自以下缓冲液含0.10-0.15M NaCl:
[0050]ρΗ5.0?7.0，浓度为0.05Μ?0.15Μ的磷酸盐(PBS)缓冲液；
[0051]步骤(3.2)中采用的标记缓冲液选自以下缓冲液含0.10-0.15Μ NaCl:
[0052]ρΗ7.0?10.0，浓度为0.05Μ?0.15Μ的磷酸盐(PBS)缓冲液；
[0053]步骤(5)所述清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或者还含0.05-0.2%吐温的该种缓冲液:
[0054]ρΗ5.0?8.0，浓度为0.005Μ?0.1M的磷酸盐(PBS)缓冲液、
[0055]ρΗ7.0?9.0，浓度为0.005Μ?IM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液。
[0056]所述步骤(1.3)中采用含0.05%吐温的清洗缓冲液则效果最佳。
[0057]所述步骤⑵中采用含0.1%吐温的清洗缓冲液则效果最佳。
[0058]所述步骤(4)中采用含0.05%吐温的清洗缓冲液则效果最佳。
[0059]步骤(I)中采用的ΗΕ4单克隆抗体为Meridian、Hytest、或Abcam公司产品。
[0060]步骤(3.2)中，吖啶酯溶液浓度为0.05-lmM，HE4标记抗体的投入量为50-500 μ g。反应的条件具体为:取吖啶酯溶液和HE4标记抗体溶液，用标记缓冲液混合，置于摇床中，在20-25°C条件下，以150?250rpm的转速反应10?30分钟；加入赖氨酸盐溶液，再次置于摇床中，在20-25°C条件下，以150?250rpm的转速反应20?50分钟；采用的标记抗体是吖啶酯或吖啶磺酰胺类化学发光物质标记的鼠单克隆HE4抗体。
[0061]步骤(4)反应的条件为:将待检样品和吖啶酯标记的HE4抗体加入金磁微粒中，置于摇床，在25-40°C条件下，以150?250rpm的转速反应30?90分钟。
[0062]上述标记用吖啶酯类化学发光物质是4-(2-琥珀酰亚氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐、B丫啶酯-NSP-DMAE-NHS，或采用吖啶磺酰胺NSP-SA-NHS。
[0063]步骤￠)中采用的化学发光底物是含有双氧水和氢氧化钠的溶液，或者在所述含有双氧水和氢氧化钠的溶液中还含有曲拉通-100和硝酸。具体操作过程中采用的化学发光底物可以分为使用前独立存在的发光激发液A和发光激发液B，其中发光激发液A中含有0.1% (体积分数)双氧水、0.05-0.5M硝酸，发光激发液B中含有0.25M氢氧化钠、
0.5% -5% (体积分数)的曲拉通-100。
[0064]本发明具有以下优点:
[0065]本发明以金磁微粒为载体，结合化学发光免疫检测系统，建立了基于金磁微粒的化学发光免疫学检测HE4的方法。使用的抗体为单克隆抗体，与抗原之间反应特异性好，有效避免交叉反应，且由于金磁微粒对蛋白质等大分子物质具有的高吸附能力，加之抗体、抗原免疫反应的高特异性，同时还兼具吖啶酯化学发光法的高灵敏度和标记物稳定、无污染的特点。在制备过程中不同步骤使用适当的缓冲溶液和PH值，使得抗体与固相载体之间有效结合，并有效进行位点封闭，避免的了非特异性反应的产生。
[0066]该方法检测灵敏度高、特异性好、线性范围宽、精密度高、稳定性好、无放射性污染，操作安全，方法简便快速。尤其在检测灵敏度、特异性、准确度及精密度方面均比酶参与的免疫检测有显著提高。
【附图说明】
[0067]图1是本发明吖啶醋标记抗体的原理示意图；
[0068]图2是实施例一中本发明抗体标记洗脱组分的吖啶酯发光值和抗体浓度检测结果;
[0069]图3是实施例一中本发明定量检测HE4的标准曲线。
【具体实施方式】
[0070]以下实施例对本发明的方案以具体实验操作的形式示例，其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限；本领域技术人员应当能够基于本发明的原理在合理的范围内确定实验条件和设定参数，仍可实现本发明的发明目的。
[0071]实施例一:一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法
[0072](I)包被
[0073](1.1)预处理:取 10mg/ml 的金磁微粒 100 μ 1，用 ρΗ7.4,0.02Μ Tris-HCl 平衡缓冲液200 μ I清洗2次，平衡磁粒的pH。
[0074](1.2)偶联:将 50 μ g 的 HE4 包被抗体溶解于 200 μ I ρΗ7.4，0.02Μ Tris-HCl 偶联缓冲液中，混匀后加入预处理过的金磁微粒中，于37°C，180rpm，摇床中反应30min。反应完毕后取出，磁性分离，弃上清。
[0075](1.3)清洗:加入300 μ I ρΗ7.4，含0.05%吐温-20的0.0lM PBS清洗缓冲液，磁性分离，弃上清，清洗3次。
[0076](2)封闭:向上述反应后的金磁微粒中加入Iml含5%脱脂奶粉和2%胎牛血清的pH7.4,0.0lM PBS缓冲液中，于37°C，180rpm，摇床中反应2h，磁性分离，弃上清。用ImlpH7.4，含0.1 %吐温-20的0.0lM PBS缓冲液清洗3次，磁粒悬于Iml pH7.4的含I %牛血清白蛋白的0.0lM PBS的保存缓冲液中，4°C备用。
[0077](3)抗体的标记:
[0078](3.1)预处理:将G-25葡聚糖凝胶脱盐柱用25mL洗脱缓冲液进行平衡。
[0079](3.2) 口丫啶酯的标记:取250 μ g的HE4抗体，加入0.5mM的吖啶醋(4- (2-琥珀酰亚氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐)溶液50μ1，加入pH8.0的含0.15ΜNaCL的0.1M PBS标记缓冲液使总反应体积为1000 μ 1，避光于25°C，180rpm，摇床中反应20min。反应完毕后取出，加入10%的赖氨酸盐溶液100 μ 1，继续避光于25°C，180rpm，摇床中反应30min。
[0080](3.3)过柱纯化:将上述反应物上样在已经平衡好的G-25脱盐柱中，用pH 6.3的含0.15M NaCL的0.1M PBS洗脱缓冲液进行洗脱并收集，洗脱速度为120drops/min，用
1.5mL试管收集洗脱液，每管收集500 μ I共收集24管，并对收集管内洗脱组分的发光值和抗体浓度进行测定，结果如图2所示，收集第4、5、6管混合作为标记有吖啶酯的ΗΕ4抗体，加入I %牛血清白蛋白和50%甘油于-20°C保存备用。
[0081](4)与待测物结合:取出包被有HE4抗体的金磁微粒，于室温下平衡15min，取出发光检测试管，依次加入上述金磁微粒30 μ 1、待测样本(0ng/ml、0.3ng/ml、0.6ng/ml、
1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml)各 100 μ 1、50 倍稀释的标记有吖啶酯的HE4抗体100 μ 1，置摇床中37°C，180rpm，反应40min，形成双抗体夹心复合物。
[0082](5)清洗:取出离心管置于磁性分离器上，弃上清，用pH7.4含0.05%吐温-20的
0.0lM PBS清洗缓冲液清洗3次，磁性分离，弃上清。
[0083](6)化学发光检测:向经过步骤(5)处理后形成的双抗体夹心复合物的金磁微粒，加入0.1M HNO3,0.1 % H2O2发光激发液A 100 μ 1，立即放入化学发光免疫检测仪内，调整仪器自动加入0.25Μ NaOH, 2% Triton-100发光激发液BlOO μ 1，检测累计时间15s，检测各孔的发光强度(RLU)，其发光强度与待测样本浓度关系如图3所示，在0.3ng/ml?25ng/ml的范围内线性较好，最低检出限可达0.069ng/mlo
[0084]结论:在抗体的吖啶