酯标记中，被吖啶酯标记上的HE4抗体约占总投入的抗体的69.77%，并且标记效率高达1.92，即每分子抗体上平均标记有1.92个吖啶酯分子；
[0085]该基于金磁微粒的化学发光检测HE4方法的浓度-发光值标准曲线显示，在
0.05ng/ml?25ng/ml的范围内具有良好线性，且通过计算后最低检测限可达0.069ng/ml。
[0086]实施例二:一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法
[0087](I)包被
[0088](1.1)预处理:取10mg/ml的金磁微粒100 μ 1，用ρΗ7.4的0.0lM磷酸盐(PBS)平衡缓冲液200 μ I清洗2次，平衡磁粒的pH。
[0089](1.2)偶联:将50 μ g的HE4包被抗体溶解于200 μ I ρΗ7.4的0.0lM磷酸盐(PBS)偶联缓冲液中，混匀后加入预处理过的金磁微粒中，于37°C，180rpm，摇床中反应30min。反应完毕后取出，磁性分离，弃上清。
[0090](1.3)清洗:加入300 μ I ρΗ7.4，含0.05%吐温-20的0.0lM PBS清洗缓冲液，磁性分离，弃上清，清洗3次。
[0091](2)封闭:向上述反应后的金磁微粒中加入Iml含5%脱脂奶粉和2%牛血清白蛋白的pH7.4，0.01M PBS缓冲液中，于37°C，180rpm，摇床中反应2h，磁性分离，弃上清。用Iml ρΗ7.4，含0.1 %吐温-20的0.0lM PBS缓冲液清洗3次，磁粒悬于Iml ρΗ7.4的含I %牛血清白蛋白的0.0lM PBS的保存缓冲液中，4°C备用。
[0092](3)抗体的标记:
[0093](3.1)预处理:将G-25葡聚糖凝胶脱盐柱用25mL洗脱缓冲液进行平衡。
[0094](3.2) 口丫啶酯的标记:取500 μ g的HE4抗体，加入0.1mM的吖啶醋(4- (2-琥珀酰亚氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐)溶液50μ1，加入pH8.0的含0.15ΜNaCL的0.1M PBS标记缓冲液使总反应体积为1000 μ 1，避光于25°C，180rpm，摇床中反应30min。反应完毕后取出，加入10%的赖氨酸盐溶液100 μ 1，继续避光于25°C，180rpm，摇床中反应40min。
[0095](3.3)过柱纯化:将上述反应物上样在已经平衡好的G-25脱盐柱中，用pH6.3的含0.15M NaCL的0.1M PBS洗脱缓冲液进行洗脱并收集，洗脱速度为120drops/min，用
1.5mL试管收集洗脱液，每管收集500 μ I共收集24管，并对收集管内洗脱组分的发光值和抗体浓度进行测定，收集第4、5、6管混合作为标记有吖啶酯的ΗΕ4抗体，加入1%牛血清白蛋白和50%甘油于-20°C保存备用。
[0096](4)与待测物结合:取出包被有HE4抗体的金磁微粒，于室温下平衡15min，取出发光检测试管，依次加入上述金磁微粒30 μ 1、待测样本(0ng/ml、0.3ng/ml、0.6ng/ml、
1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml)各 100 μ 1、50 倍稀释的标记有吖啶酯的HE4抗体100 μ 1，置摇床中37°C，180rpm，反应50min，形成双抗体夹心复合物。
[0097](5)清洗:取出离心管置于磁性分离器上，弃上清，用pH7.4含0.05%吐温-20的0.0lM PBS清洗缓冲液清洗3次，磁性分离，弃上清。
[0098](6)化学发光检测:向经过步骤(5)处理后形成的双抗体夹心复合物的金磁微粒，加入0.3M HNO3,0.1 % H2O2发光激发液A 100 μ 1，立即放入化学发光免疫检测仪内，调整仪器自动加入0.25Μ NaOH，0.5% Triton-100发光激发液B ΙΟΟμΙ，检测累计时间15s，检测各孔的发光强度(RLU)，其发光强度与待测样本浓度关系在一定范围成正比，其中在0.3ng/ml?25ng/ml的范围内线性较好，最低检出限可达0.086ng/ml。
[0099]结论:在抗体的吖啶酯标记中，被吖啶酯标记上的HE4抗体约占总投入的抗体的63.51%，并且标记效率高达1.83，即每分子抗体上平均标记有1.83个吖啶酯分子；
[0100]该基于金磁微粒的化学发光检测HE4方法的浓度-发光值标准曲线显示，在
0.05ng/ml?25ng/ml的范围内具有良好线性，且通过计算后最低检测限可达0.086ng/ml。
[0101]实施例三:一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测人附睾分泌蛋白4(HE4)的方法
[0102](I)包被
[0103](1.1)预处理-M 10mg/ml 的金磁微粒 100 μ 1，用 pH8.0,0.1M Tris-HCl 平衡缓冲液200 μ I清洗2次，平衡磁粒的pH。
[0104](1.2)偶联:将 50 μ g 的 HE4 包被抗体溶解于 200 μ I ρΗ8.0,0.1M Tris-HCl 偶联缓冲液中，混匀后加入预处理过的金磁微粒中，于37°C，180rpm，摇床中反应30min。反应完毕后取出，磁性分离，弃上清。
[0105](1.3)清洗:加入 300 μ I ρΗ7.4，含 0.05%吐温-20 的 0.1M Tris-HCl 清洗缓冲液，磁性分离，弃上清，清洗3次。
[0106](2)封闭:向上述反应后的金磁微粒中加入Iml含5%脱脂奶粉和2%胎牛血清的pH8.0,0.1M Tris-HCl缓冲液中，于37°C，180rpm，摇床中反应2h，磁性分离，弃上清。用ImlpH7.4，含0.1 %吐温-20的0.0lM PBS缓冲液清洗3次，磁粒悬于Iml pH7.4的含I %牛血清白蛋白的0.0lM PBS的保存缓冲液中，4°C备用。
[0107](3)抗体的标记:
[0108](3.1)预处理:将G-25葡聚糖凝胶脱盐柱用25mL洗脱缓冲液进行平衡。
[0109](3.2)吖啶酯的标记:取250 μ g的HE4抗体，加入0.5mM的吖啶酯(吖啶酯-NSP-DMAE-NHS)溶液50 μ 1，加入ρΗ9.0的含0.10Μ NaCL的0.15Μ PBS标记缓冲液使总反应体积为1000 μ 1，避光于25°C，180rpm，摇床中反应20min。反应完毕后取出，加入10%的赖氨酸盐溶液100 μ 1，继续避光于25°C，180rpm，摇床中反应30min。
[0110](3.3)过柱纯化:将上述反应物上样在已经平衡好的G-25脱盐柱中，用pH5.8的含0.10M NaCL的0.15M PBS洗脱缓冲液进行洗脱并收集，洗脱速度为120drops/min，用
1.5mL试管收集洗脱液，每管收集500 μ I共收集24管，并对收集管内洗脱组分的发光值和抗体浓度进行测定，收集第4、5、6管混合作为标记有吖啶酯的ΗΕ4抗体，加入1%牛血清白蛋白和50%甘油于-20°C保存备用。
[0111](4)与待测物结合:取出包被有HE4抗体的金磁微粒，于室温下平衡15min，取出发光检测试管，依次加入上述金磁微粒30 μ 1、待测样本(0ng/ml、0.3ng/ml、0.6ng/ml、
1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml)各 100 μ 1、50 倍稀释的标记有吖啶酯的HE4抗体100 μ 1，置摇床中37°C，180rpm，反应40min，形成双抗体夹心复合物。
[0112](5)清洗:取出离心管置于磁性分离器上，弃上清，用pH8.0含0.05%吐温-20的0.1M Tris-HCl清洗缓冲液清洗3次，磁性分离，弃上清。
[0113](6)化学发光检测:向经过步骤(5)处理后形成的双抗体夹心复合物的金磁微粒，加入0.1M HNO3,0.1 % H2O2发光激发液A 100 μ 1，立即放入化学发光免疫检测仪内，调整仪器自动加入0.25Μ NaOH, 2% Triton-100发光激发液BlOO μ I，检测累计时间15s，检测各孔的发光强度(RLU)，其发光强度与待测样本浓度关系在一定范围内成正比，在0.3ng/ml?25ng/ml的范围内线性较好，最低检出限可达0.12ng/ml。
[0114]结论:在抗体的吖啶酯标记中，被吖啶酯标记上的HE4抗体约占总投入的抗体的72.53%，并且标记