一种前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种前列腺小体外泄蛋白抗原，具体涉及一种该前列腺小体外泄蛋白 抗原及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 慢性前列腺炎（ChronicProstatitis，CP)是泌尿外科中青年男性最常见的疾病 之一，据报道其占门诊量的30%。据流行病学调查，我国成人男性人群中，10%以上有前列腺 炎样症状，50%男性不同时期均患过前列腺炎。说明潜在的慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛 (CPPS)患者众多。同时，由化学品、物理因素或生物制剂引起的炎症过程还是人类癌症的发 病机制中重要因子。在前列腺癌中，炎症的存在及细胞上皮组织损伤后再生被认为是恶性 转化的关键因素（DeMarzoetal.，2007)。前列腺组织受到炎性细胞的浸润，从而释放出各种 活性物质，这些物质的释放还与细菌及病毒感染、尿酸增高及食用前列腺致癌物有关。在过 去10年中，炎症和癌症之间的联系，以及前列腺炎作为前列腺癌高危因素的假说已经在流 行病学、临床、形态学、病原学、细胞和分子水平上进行充分的研究并得到证实。事实上，文 献中指出，大约12%以上前列腺炎症，如不及时治疗可转化为前列腺癌。所以前列腺炎严重 影响男性健康（陈智彬etal.，2009 ;那彦群etal.，2011)。
[0003] 前列腺炎临床表现因患者个体差异而缺乏特异性，因此在临床上治疗效果一直 不满意（Kriegeretal.，1999 ;Engeleretal.，2012 ;那彦群etal.，2011)。根据 1997 年 美国国立卫生研究院（NIH)对前列腺炎的分类，即NIH分类法（Kriegeretal.,1999;陈 智彬etal.，2009)，包括I型：急性细菌性前列腺炎（ABP) ;II型：慢性细菌性前列腺炎 (CBP) ;111型：又分为IIIA，慢性非细菌性前列腺炎（CAP)和IIIB，慢性骨盆疼痛综合征 (CPPS) ;IV型：无症状的炎症性前列腺炎（AIP)。临床实践中，通常以III型慢性前列腺炎多 见，约占90%左右，所以慢性前列腺炎主要指的是III型慢性前列腺炎。在临床实际工作中， 泌尿男科医师对首诊的CAP和CPPS患者选择的检查方法（多选）前3位是尿常规（80. 3%)、 前列腺按摩液检查（71. 0%)、体检（包括直肠指检）（63. 2%)。前列腺按摩液检查和直肠指 检对患者有一定侵入性，而大多数诊断却仍然依赖于临床表征和医生经验，因此非常需要 简便无侵入性，同时准确可靠的分子诊断方法。
[0004] 中国申请CN102998455A公开了 一种检测或诊断前列腺癌的试剂盒，其包含 5 -catenin吸附抗体、包被缓冲液、洗漆缓冲液、封闭缓冲液、5 -catenin检测抗体、酶标 抗体。或包含S-catenin吸附抗体、包被缓冲液、洗漆缓冲液、封闭缓冲液、S-catenin检 测抗体、纳米量子点标记。所述试剂盒能够从病人尿液中用ELISA方法检测与前列腺癌成 高度相关性的S-catenin蛋白，而且ELISA方法成熟，敏感性和特异性较高，对病人是非侵 袭性的，能够重复采取，病人乐于接受。纳米量子点（QD)标记法取样量小，将ELISA方法中 所用的抗体与QD结合，能更灵敏地检测尿液中S-catenin蛋白的变化，从而用于诊断前列 腺癌。但是，该试剂盒仅适用于前列腺癌检测，不能很好区分慢性前列腺炎症病人和正常人 样品，故不适用于前列腺炎症检测。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一目的即在于提供一种可用于前列腺炎症检测的前列腺小体外泄蛋 白抗原。
[0006] 本发明所述的前列腺小体外泄蛋白抗原，采用如下方法制备而成：
[0007] 取500毫升慢性前列腺炎症病人晨尿中段尿，加入等量pH7. 3的HEPES缓冲液和 蛋白酶抑制剂，用纱布过滤；取过滤液分别置于10只50毫升离心管，在4°C低温下400g 离心10分钟，去沉淀，取上清液在4°C低温下10, 000g离心20分钟，去沉淀，取上清液分别 置于200只3毫升超速离心管，在4°C低温下100,000g离心120分钟；倒去上清液，取沉淀 加入2. 5毫升pH7. 8的TBS缓冲液和蛋白酶抑制剂，混匀；在4°C低温下100,000g离心 120分钟，倒去上清液，取沉淀分别溶于2. 5毫升0. 5%NP-40,80mMNaCl, 0. 2%Deoxycholate ，50mMTris，pH8.0和蛋白酶抑制剂；在4°C低温下100,000g离心20分钟；取上清液，上样 TSKgelG3000PW，280纳米读数，取在40kDa区域峰值蛋白，-80°C冷冻保存，即得。
[0008] 同时，本发明进一步保护了上述前列腺小体外泄蛋白抗原的制备方法：
[0009] 取500毫升慢性前列腺炎症病人晨尿中段尿，加入等量pH7. 3的HEPES缓冲液和 蛋白酶抑制剂，用纱布过滤；取过滤液分别置于10只50毫升离心管，在4°C低温下400g 离心10分钟，去沉淀，取上清液在4°C低温下10, 000g离心20分钟，去沉淀，取上清液分别 置于200只3毫升超速离心管，在4°C低温下100,000g离心120分钟；倒去上清液，取沉淀 加入2. 5毫升pH7. 8的TBS缓冲液和蛋白酶抑制剂，混匀；在4°C低温下100,000g离心 120分钟，倒去上清液，取沉淀分别溶于2. 5毫升0. 5%NP-40,80mMNaCl, 0. 2%Deoxycholate ，50mMTris，pH8.0和蛋白酶抑制剂；在4°C低温下100,000g离心20分钟；取上清液，上样 TSKgelG3000PW，280纳米读数，取在40kDa区域峰值蛋白，-80°C冷冻保存，即得。
[0010] 上述制备方法可以快速批量制备所述的前列腺小体蛋白外泄蛋白抗原，所述方法 稳定可再现，便于推广应用。
[0011] 本发明的另一目的在于保护与上述抗原特异对应的抗体。
[0012] 本发明的再一目的在于保护上述抗原和抗体在制备检测或诊断前列腺癌的试剂 盒中的应用。
[0013] 上述试剂盒可采用现有技术公开的多种制备方法制备而成，本领域技术人员可知 晓，在得到本发明所述前列腺小体外泄蛋白抗原及其抗体的情况下，基于这种特殊抗原及 抗体对前列腺小体外泄蛋白准确的检测作用，无论采用哪种制备方法，都能得到可用于检 测或诊断前列腺癌的试剂盒。
[0014] 本发明优选所述的试剂盒采用ELISA法或胶体金法制备而成。
[0015] 本发明所述的试剂盒包含针对前列腺小体外泄蛋白抗原的单克隆检测抗体、包被 缓冲液、洗涤缓冲液、封闭缓冲液、酶标抗体。具体组成为本领域技术人员所理解，本发明对 此不作特别限定。
[0016] 其中，本发明所述前列腺小体外泄蛋白抗原检测抗体为单克隆鼠抗人前列腺小体 外泄蛋白抗原的抗体。
[0017] 进一步地，该试剂盒还包含标准品和阴性对照；所述标准品为对前列腺小体外泄 蛋白检测抗体产生免疫反应的人前列腺小体外泄蛋白抗原。
[0018] 其中，所述试剂盒包被缓冲液为碳酸盐或dPBS;所述洗涤缓冲液为含洗涤剂的 dPBS。
[0019] 所述检测抗体识别前列腺小体外泄蛋白抗原。
[0020] 本发明所述的试剂盒，使用时，具体的流程如下：
[0021] 1、准备：
[0022] ①从2_8°C冷藏环境中取出试剂盒，将BSA粉剂倒入PBS缓冲液瓶中预制封闭液 (必要时在倒空粉剂后再用移液器把PBS缓冲液吸入BSA粉剂管中，摇匀后再倒入PBS缓冲 液瓶中，以免粉剂粘附在管壁上)，充分混匀。
[0023] ②将20X浓缩清洗液50ml(两瓶）摇匀后完全倒入洗板机的洗液瓶中（如有沉淀 晶体可置于37°C条件下溶解)，再倒入纯化水（电阻率在15MQ以上)，定容至1000ml，充分 混匀。
[0024] 2、编号：从铝箔袋中取出微孔板。A1为空白孔，A2-A6孔包被了阳性标准品的5个 工作浓度：〇.lng;lng;2ng;5ng; 10ng。其余各孔按照需要顺序编号。
[0025] 3、加