异抗体克隆株。在RPMI1640+小牛血清扩大培养后用慢性 前列腺炎症尿液验证阳性抗体并对免疫球蛋白分型得到IgG。培养液扩大到3000毫升，取 上清液，加样到蛋白A/G层析柱上进行纯化得到PSEP纯化抗体。
[0051] 2?试剂和仪器：96孔聚苯乙烯检查板由美国Becton-Dickson及美国 ThomasFisherScientific提供；HRP标记的羊抗鼠抗体IgG购自Sigma公司；清洗液、显色 齐U、终止液采用本室配制品，并与上海科华生物技术有限公司产品进行了比较。TMB、过氧化 氢脲、吐温20、柠檬酸、乙酸钠、EDTA、硫代硫酸等均购自国药集团化学试剂苏州有限公司。
[0052] DEM-III自动酶标洗板机，采用北京拓普分析仪器有限公司。酶标仪（680型） 购自BI0-RAD公司。WHS型智能恒湿恒温箱，购自宁波江南仪器厂。微量移液器，采用 Eppendorf,Gilson品牌。
[0053] 二、方法
[0054] 1.ELISA检测：（间接ELISA方法）
[0055] 将稀释为一定比例的PSEP蛋白标准品包被在96孔板中（A2-A6孔），其余孔加尿 液标本，37°C恒温箱孵育1小时，洗板机洗板5次后，加1%BSA封闭，每孔100微升，37°C恒 温箱孵育40分钟，洗板5次。加入特异性PSEP检测抗体，37°C恒温箱孵育40分钟，洗板 后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG，37°C恒温箱孵育20分钟，洗板后避光显色20分钟，加入终 止液，终止反应。用酶标仪测定各反应孔在双波450nm/630nm处的0D值。根据不同浓度的 标准品0D值绘出标准曲线，将病人的数值与阳性标准孔数值比较，从而得出被测试者尿样 本的实际PSEP浓度。
[0056] 2.自配清洗液、显色剂、终止液：清洗液为含0. 05%吐温-20的PBS溶液；显色剂 A含柠檬酸、乙酸钠、过氧化脲；显色剂B含柠檬酸、EDTA、TMB盐酸盐、1%硫代硫酸钠溶液； 终止液为2mol/LH2S04。
[0057] 3.样本检测：用间接ELISA方法检测前列腺炎症和正常人尿样本。根据临床样本 检测真阳性a、假阳性b、假阴性c、真阴性d，求出检测灵敏度、特异度、阳性预期值、阴性预 期值并计算Cutoff值。
[0058] 4?方法学鉴定：
[0059] 4. 1分析精密度：批内变异：用两个浓度水平的样本(炎症和正常人）各重复检测 10次，计算10次测量浓度结果的平均值M和标准差SD，得出变异系数CV。
[0060] 批间差：用3个批号的试剂盒分别检测同样两份标本，各重复10次，计算30次结 果的平均值M和标准差SD，求出变异系数CV。
[0061] 4. 2各组成部分的稳定性实验：检测酶联板、特异性抗体、酶标抗体、显色剂、阳性 标准品等在37°C分别保存3天、5天、7天后所测得的0D值。并将各个组成部分放入4°C冰 箱，每月检测一次，观察有效期限。
[0062] 4. 3正交实验：把特异性结合抗体按照1:50、1:100稀释；酶标抗体按照1:2000、 1:2500、1:3000、1:5000稀释，然后先加样本37°C孵育一小时，洗板封闭后，加不同浓度的 特异性抗体后，37°C孵育40分钟，洗板5次后加入不同浓度的酶标抗体，37°C孵育20分钟 后，洗板显色。根据0D值数据选出最佳的特异抗体和酶标抗体的使用浓度。
[0063] 4. 4样本孵育时间的验证：样本的孵育时间将直接影响测试效果，因此在确定所 用抗体、试剂的前提下测定样本的孵育时间。本实施例比较了不同的孵育时间（2小时、1小 时、40分钟）对检测结果的影响，从而找出对临床检测的最佳孵育时间。
[0064] 4. 5不同显色剂的比较：本实施例用上海科华的显色剂作为对照，检测所配制的 显色剂的显色性能。
[0065] 4. 6不同检测方法的比较（ELISA双抗夹心法和间接法）：检测方法的确定对于检 测效果具有至关重要的作用，在确定了抗体和试剂及测试时间以后必须对检测方法进行筛 选，本实施例比较了双抗夹心法和间接法对检测结果的影响。
[0066] 5.统计学处理：采用SPSS17. 0统计软件进行统计学处理。炎症病人与正常人的 样本差异比较采用秩和检验。P< 0. 05为差异有统计学意义。
[0067] 试验结果
[0068] 一、临床样本检测结果：应用本试验所建立的间接ELISA检测方法，分别对176份 慢性前列腺炎患者的尿样和100例正常人的尿样进行检测，结果如下：慢性前列腺炎患者 经由临床症状，前列腺炎按摩液卵磷脂小体减少，无其他相关疾病为参照。正常人群参照为 无临床症状，尿常规正常。
[0069] 表1慢性前列腺炎患者和对照人群中PSEP蛋白含量对照
[0081] *表注：PSEP含量为ng/ml，根据检测吸光度的0D值，由标准曲线换算获得。同时， 每个数据重复三次测量，取平均值计算。
[0082] 表2患者和正常人群中PESP含量比较（ng/ml)
[0085] * 表注：Z=10. 74P〈0. 05
[0086] 患者和对照人群中PSEP含量数据分析显示，就目前数据而言，PSEP含量在前列 腺炎患者中和正常人中呈非正态分布。采用秩和检验对两组数据加以比较，显示患者和对 照组中PSEP含量的分布存在显着性差异，患者样本中检测到的PSEP的浓度高于对照组中 PSEP的浓度。
[0087] 根据图1，从本研究得出，如果临界点设置为1. 17ng/ml，PSEP试剂盒检测慢性前 列腺炎症的灵敏度可达82. 39%，特异性可达87%。在R0C区域下面积可达0.89.表示PSEP 试剂盒对慢性前列腺炎具有较好的诊断价值。
[0088] 表3R0C曲线不同截断点的灵敏度和特异度
[0090] 选择Youden指数最大的点对应的介值作为慢性前列腺炎的诊断标准，得出PSEP 的诊断点为1. 17ng/ml。
[0091] 表4以PSEP抗体检测慢性前列腺炎的灵敏度和特异度
[0093] 二、PSEP检测方法学鉴定
[0094] 1.分析精密度：用两个浓度水平的样本(慢性前列腺炎阳性和阴性）各重复检测 10次，计算10次测量浓度结果（0D)的平均值M和标准差SD，得出变异系数CV小于8%。用 3个批号的试剂盒分别检测同样两份标本，（阳性和阴性)各重复10次，计算30次结果的平 均值M和标准差SD，其变异系数CV为10. 1%。结果见表5。从以下数据可以看出该试剂盒 反应体系具有良好的精密度。
[0095] 表5反应体系的精密度检测
[0098] 2.试剂盒在37°C条件下稳定性的评价：将组装好的前列腺炎PSEP蛋白检测试剂 盒置于37°C进行加速破坏试验，结果见表6。发现在37°C恒温箱中7天时，其阳性样本0D 值为当天配制试剂检测的81%，P/N>4。如按照每次的标准曲线换算为ng值，7天后的阳性 样本数值仍是〇天的阳性样本数值的96%。从实验结果可以看出37°C保存7天后，实验结 果基本保持稳定。包被在酶联板上的抗原标准品分别放入37°C恒温箱3天、5天、7天后， 阳性标准品的标准曲线R 2值都大于0. 99。有文献指出37°C每保存一天相当于4°C保存45 天，所以可以推算试剂盒主要成分可以在低温保存多月而保持稳定。
[0099] 表637°C破坏性试验结果
[0101] 3.试剂盒在4°C条件下保存的稳定性实验评价：
[0102] 本实施例进一步将前列腺炎PSEPELISA试剂盒置4°C条件下干燥保存，每月定期 抽检直至12个月，检测前列腺炎阳性样本和正常人样本。结果见表7。从表中数据可见 1-12月，阳性样本ng值每月无明显降低，阴性样本数值稳定，均在lng以下。P/NM.7。各 月的标准品曲线R 2值都在〇. 99以上，非常接近1。在保存12个月后，阳性