一种马兜铃酸a快速检测卡及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种马兜铃酸A快速检测卡及其检测方法，是一种检测马兜铃酸A的检测器具，属于马兜铃酸A检测技术领域。
【背景技术】
[0002]马兜铃酸类化合物是马兜铃科马兜铃属植物特有的一类硝基菲类化合物，包括马兜铃酸A、B、C和D等。在我国作为药用的马兜铃科马兜铃属植物包括马兜铃、关木通、广防己、朱砂莲、大叶马兜铃、汉中防己、寻骨凤等，这些中药含有马兜铃酸及其硝基菲类有机酸衍生物或马兜铃内酰胺成分。早期发现此类化合物可以抑制肿瘤细胞，后又发现其具有镇痛、消炎、祛痰、利尿、调节血压等作用以及可预防化、放疗引起的白细胞减少，因此此类中药在临床上得到了广泛的应用。
[0003]近年来，马兜铃酸的肾毒性已引起广泛关注，各国纷纷对含马兜铃酸的中药采取管制及限制措施。研宄表明马兜铃酸类化合物的毒性主要由马兜铃酸A或其代谢物马兜铃内酰胺所致。因此，在检测马兜铃酸时，常选择马兜铃酸A为指标性成分。目前，检测马兜铃酸的方法主要有薄层色谱法、紫外分光光度法、高效液相色谱法及酶联免疫分析法等。薄层色谱法和紫外分光光度法灵敏度较低；高效液相色谱法灵敏度较高、测定准确，是目前测定马兜铃酸最常用的方法，但仪器设备昂贵，对实验人员专业技能要求高。例如:
[0004]对比文件CN102579961A公开了一种消肿止痛酊中马兜铃酸A的质量控制方法，该对比文件是运用高效液相色谱仪进行检测。
[0005]对比文件公开了 CN103063799A公开了一种龙胆泻肝颗粒有效成分的检测方法，通过高效液相色谱仪对马兜铃酸A的含量进行检测，更有利于降低其毒副作用。
[0006]因此克服现有技术中存在的问题，建立一种准确可靠又快速方便的检测食品中马兜铃酸A的分析方法是非常必要的。
[0007]本发明拟发明一种基于小分子物质马兜铃酸A偶联蛋白质后而具有抗原性的免疫学检测方法，采取免疫学竞争法的原理，结合胶体金(或乳胶颗粒)标记技术和免疫层析法设计的一种快速检测试剂，可快速特异地检测中药材或中成药中的马兜铃酸A。根据检测卡样品检测线(T)和质控线(C)的有无显色来判定样品中的马兜铃酸A含量。反应是利用马兜铃酸A蛋白质偶联物抗原性而建立的一种检测方法，具有特异性强的优点，可避免其它检测方法的假阳性导致的误检问题。同时检测卡操作简单快速，无需特殊的仪器设备，适合现场操作。由于样本量需要少、简便快速，适用于大量样本的筛查。结果准确，灵敏度高，准确率大。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种能快速检测马兜铃酸A的检测器具，直接应用免疫学的方法检测中药材或中成药中马兜铃酸A的含量，克服现有色谱法检测的操作繁琐等缺点，建立基于免疫学特异性的检测方法。
[0009]为解决本发明的技术问题，所采用的技术方案如下:
[0010]一种马兜铃酸A快速检测卡包括在长条扁平薄壳状的检测卡外壳和设置在外壳中的测试条；所述检测卡外壳表面有检测窗孔和加样孔；所述测试条是多层结构的窄条薄片，由支承背板上通过不干胶在其上依次粘贴样品垫、胶体金膜、硝酸纤维素膜、和吸水膜所组成；所述支承背板中部叠置粘贴硝酸纤维素膜，所述支承背板一端叠置粘贴吸水膜，另一端叠置粘贴样品垫，所述吸水膜内端与所述样品垫内端各自分别与硝酸纤维素膜搭接，在所述样品垫与硝酸纤维素膜的搭接部，两者之间夹置粘贴一段胶体金膜；所述胶体金膜为抗马兜铃酸A抗体胶体金标记的玻璃纤维膜；所述硝酸纤维素膜上依次设有一条检测带和一条质控带，所述检测带为含马兜铃酸A蛋白质偶联物的检测带；所述质控带为含抗鼠抗体或抗兔抗体的质控带；所述测试条置入检测卡外壳内，所述样品垫正对加样孔，所述硝酸纤维素膜正对检测窗孔。
[0011]所述胶体金膜也可以为乳胶颗粒膜，所述乳胶颗粒膜为含抗马兜铃酸A抗体乳胶颗粒标记的玻璃纤维膜。
[0012]优选地，所述检测卡外壳由壳盖与壳座两半联接构成，所述检测窗孔和加样孔开设在所述检测卡外壳壳盖上。
[0013]优选地，所述长条扁平薄壳状的检测卡外壳由长70mm，宽20mm，厚5mm，薄壳壁厚Imm的工程塑料制成。
[0014]优选地，所述测试条片长60mm，片宽4mm，厚度2.5mm。
[0015]优选地，所述支承背板，为聚氯乙稀塑料薄片，厚约0.5mm，长60mm，宽4mm。
[0016]优选地，所述样品垫为吸水玻璃纤维膜，厚0.5-0.8mm，长20mm，宽4臟。
[0017]优选地，所述胶体金膜厚0.5-0.8mm,长5mm，宽4mm。
[0018]优选地，所述硝酸纤维素膜厚0.5mm，长20_25mm，宽4mm ;所述检测带和质控带在所述硝酸纤维素膜上横向间隔开排列。
[0019]优选地，所述吸水膜为吸水纸，厚0.5-0.8mm，长16_20mm，宽4臟。
[0020]优选地，所述胶体金膜、样品垫及吸水膜与所述硝酸纤维素膜的搭接长度为1-2mmο
[0021]本发明还涉及一种采用上述马兜铃酸A快速检测卡快速检测马兜铃酸A的检测方法，该方法是应用免疫学的方法直接检测待检样品中马兜铃酸A的含量，待检样品为川木通、广防己、关木通等中药材或含有马兜铃酸药材的中成药，具体处理方法如下:
[0022]①提取样品液:取川木通、广防己、天仙藤、青木香、关木通和马兜铃等中药材磨成细粉，过60目筛(0.30mm孔径)，称取0.5g ;中成药如双香排石颗粒、龙胆泻肝丸等1.0g于试管中。以5mL甲醇浸提，超声15min，以4000r/min离心1min取上清液，甲醇重复提取一次，合并两次所得溶液，氮气吹干，以20mL无水甲醇或0.0lmol/LPBS溶解残余物，即得马兜铃酸提取液。
[0023]②检测卡检测:先将所述马兜铃酸提取液从所述加样孔中滴注入所述马兜铃酸A快速检测卡的样品垫上，由于虹吸作用原理，带动所述马兜铃酸提取液及胶体金膜中所含的抗马兜铃酸A抗体胶体金标记物一起向所述硝酸纤维素膜扩散，5-10分钟内观察结果。
[0024]③检测结果对比:检测卡的主要反应是免疫学的抗原和抗体反应，在所述加样孔中加入马兜铃酸提取液后，在硝酸纤维素膜上迀移的胶体金标记的抗马兜铃酸A抗体，在测试带上分别与检测带含马兜铃酸A蛋白质偶联物，以及质控带所含有的抗兔抗体或抗鼠抗体反应，形成棕红色条带。若样品中有待检马兜铃酸A存在，当样品加入后即与质控带所含有的抗兔抗体或抗鼠抗体发生反应，而不会与检测带241所含的马兜铃酸A蛋白质偶联物反应，从而不显色。主要反应的结果有以下3种情况:
[0025]a、当检测带和质控带同时显现棕红色印迹带，检测结果为阴性，表示被检测样品中马9?铃酸A含量未超标(< 10 μ g/g)；
[0026]b、当检测带不显示颜色，只有质控带显现棕红色印迹，检测结果为阳性，表示被检测样品中马9?铃酸A含量超标(> 10 μ g/g)；
[0027]C、当检测带和质控带均不显色，则表明测试条已失效。
[0028]本发明的有益效果:本发明能快速、特异地检测中药材或中成药中含有的马兜铃酸A，本发明易于制备且节省检测费用，使用方便，检测快速，灵敏度高，结果准确。
【附图说明】
[0029]为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0030]图1为本发明马兜铃酸A快速检测卡外壳及测试条在外壳内的安置示意图；
[0031]图2为本发明的马兜铃酸A快速检测卡的测试条结构示意图；
[0032]图3为本发