明的马兜铃酸A快速检测卡的测试条的硝酸纤维素膜上显示印迹示意图；
[0033]附图标注说明:
[0034]1、外壳；11、检测窗孔；12、加样孔；
[0035]2、测试条；21、支承背板；22、样品垫；23、胶体金膜(或乳胶颗粒膜)；24、硝酸纤维素膜；25、吸水膜；241、检测带；242、质控带。
【具体实施方式】
[0036]以下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步描述:
[0037]一、抗马兜铃酸A抗体的制备实施例
[0038]1、马兜铃酸A免疫抗原和包被抗原的制备
[0039]称取80mg马兜铃酸A，加入15mg戊二酸酐，溶于4ml吡啶，室温下反应24小时。然后用氮气吹干，加入8ml 二甲基亚砜一二氧六环(1:1)，加入60 μ L三丁胺，水浴搅拌10分钟，再加入30 μ L氯甲酸异丁酯，搅拌I小时。冷浴下逐滴加入到10mg溶于ρΗ8.5硼酸盐缓冲液的牛血清白蛋白(BSA)或70mg溶于ρΗ8.5硼酸盐缓冲液的鸡卵清白蛋白(OVA)，室温下反应12小时，反应产物用0.01mol/L pH7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)透析3d，冷冻干燥，-20°C保存。
[0040]2、制备抗马兜铃酸A单克隆抗体；
[0041]2.1动物免疫；
[0042]用无菌PH7.5的PBS液将合成的免疫原马兜铃酸A-OVA偶联物溶解，然后按免疫原与弗氏佐剂体积按1:3的比例充分乳化制成油乳剂疫苗；首次免疫用弗氏完全佐剂，对8?10周龄Balb/c小鼠进行免疫，颈背部皮下多点注射，免疫剂量为100 μ L/只；14天后采用弗氏不完全佐剂第二次免疫，免疫剂量60 μ L/只；以后相继免疫4次；第6次免疫后加强免疫，不加佐剂，直接采用生理盐水免疫；
[0043]2.2细胞融合与培养；
[0044]将产生马兜铃酸A特异性抗体的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5:1体积比例混合，将混合好的细胞离心，倒干上清液，把沉淀细胞块弹成糊状，置37 °C水浴，在Imin内加入Iml融合剂聚乙二醇0.8mL，轻轻混匀细胞，静置90Sec，加入DMEM无血清培养基终止反应，加入速度为前2min lml/min，第3min 2ml/min，第4min 5ml/min，此时即可将剩余DMEM倒入离心管，终体积为25?30ml，800rpm离心7min，弃去上清液；用20?50mlHAT培养基重悬细胞，铺种于含饲养细胞96孔细胞培养板，每孔150yL ;置37°C，二氧化碳体积浓度5 %的培养箱中培养；
[0045]2.3细胞筛选与亚克隆；
[0046]待细胞长至孔底面积的1/2?1/3时，采用直接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性细胞孔；将阳性细胞在检测后2天内采用有限稀释法进行亚克隆，直到得到稳定的能够分泌马兜铃酸A单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0047]2.4单克隆抗体的腹水制备和纯化；
[0048]A.小鼠致敏:液体石錯致敏Balb/c小鼠，6?8周，注射体积500 μ L/只；7天后制备腹水；
[0049]B.注射细胞:收集杂交瘤细胞并用DMEM洗细胞两遍，取15?10 6个细胞注射于小鼠腹腔，一周后小鼠状态不活跃，并且小鼠的腹腔肿大；
[0050]C.腹水采集:注射细胞5天后对腹腔肿大的小鼠用无菌注射器于小鼠腹腔采集腹水，每隔一到两天采集一次，这样多次反复采集直到小鼠自然死亡；
[0051]D.腹水纯化:采集到的腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法粗纯化，亲和层析法进行纯化，纯化后的腹水放入-20°C环境保存，腹水在使用前经过0.0lmol/LNaCl于4°C环境下透析48h，中间每隔6?8h换液一次。
[0052]二、检测卡实施例
[0053]检测卡实施例1
[0054]一种马兜铃酸A快速检测卡，如图1所示，它是在检测卡外壳I中设置测试条2，检测卡外壳I为长条扁平薄壳状外壳，长70mm，宽20mm，厚5mm，薄壳壁厚1mm，由工程塑料制成。检测卡外壳I由壳盖与壳座两半联接构成，在检测卡外壳I壳盖上有检测窗孔11和加样孔12。测试条2放置在检测卡外壳I的壳座内。
[0055]如图2所示，测试条2是多层结构的窄条薄片，片长约60mm，片宽约4mm，厚度约2.5mm。测试条2为多层结构，底层是支承背板21，为聚氯乙烯塑料薄片，厚约0.5mm，长60mm，宽4mm ;支承背板21中部叠置粘贴硝酸纤维素膜24，硝酸纤维素膜24厚0.5mm，长20-25mm，宽4mm。如图3所示，硝酸纤维素膜24上有二条间隔开的横向显示印迹带，二条显示印迹带中，一条是检测带241，含马兜铃酸A蛋白质偶联物；另一条是质控带242，含抗鼠抗体。支承背板21 —端部上叠置粘贴吸水膜25，支承背板21另一端部上叠置粘贴样品垫22，吸水膜25内端与样品垫22内端各自分别与硝酸纤维素膜24 —端搭接，在样品垫22与硝酸纤维素膜24的搭接部，两者之间夹置粘贴一段胶体金膜23，胶体金膜23是含抗马兜铃酸A抗体胶体金标记物的玻璃纤维膜。胶体金膜23厚0.5-0.8_，长5_，宽4_。样品垫 22 厚 0.5-0.8mm,长 20_，宽 4_。吸水膜 25 厚 0.5-0.8mm,长 16-20_，宽 4_。胶体金膜23、样品垫22及吸水膜25与硝酸纤维素膜24搭接长度为l_2mm。吸水膜25材料是吸水纸，样品垫22材料是吸水玻璃纤维膜。
[0056]检测卡实施例2
[0057]本实施例与检测卡实施例1的区别在于:⑴胶体金膜23为乳胶颗粒膜，乳胶颗粒膜为含抗马兜铃酸A抗体乳胶颗粒标记的玻璃纤维膜；(2)所述质控带242内含有的是抗兔抗体。
[0058]三、检测方法实施例
[0059]本实施例的检测方法是采用检测卡实施例1中所述的检测卡，检测川木通、广防己、关木通等中药材或含有马兜铃酸药材的中成药样品中马兜铃酸A的含量，具体处理方法如下:
[0060]①提取样品液:取川木通、广防己、天仙藤、青木香、关木通和马兜铃等中药材磨成细粉，过60目筛(0.30mm孔径)，称取0.5g ;或称取中成药如双香排石颗粒、龙胆泻肝丸等1.0g于试管中。以5mL甲醇浸提，超声15min，以4000r/min离心1min取上清液，甲醇重复提取一次，合并两次所得溶液，氮气吹干，以20mL无水甲醇或0.0lmol/LPBS溶解残余物，即得马兜铃酸提取液。
[0061]②检测卡检测:先将所述马兜铃酸提取液从所述加样孔12中滴注入所述马兜铃酸A快速检测卡的样品垫22上，由于虹吸作用原理，带动所述马兜铃酸提取液及胶体金膜23中所含的抗马兜铃酸A抗体胶体金标记物一起向所述硝酸纤维素膜24扩散，5-10分钟内观察结果；
[0062]③检测结果对比:检测卡的主要反应是免疫学的抗原和抗体反应，在所述加样孔12中加入马兜铃酸提取液后，在硝酸纤维素膜上24迀移的胶体金标记的抗马兜铃酸A抗体，在测试带上分别与检测带241含马兜铃酸A蛋白质偶联物，以及质控带242所含有的抗兔抗体或抗鼠抗体反应，形成棕红色条带；若样品中有待检马兜铃酸A存在，当样品加入后即与质控带242所含有的抗兔抗体或抗鼠抗体发生反应，而不会与检测带241所含的马兜铃酸A蛋白质偶联物反应，从而不显色；
[0063]a、当检测带241和质控带242同时显现棕红色印迹带，检测结果为阴性，表示被检测样品中马9?铃酸A含量未超标(< 10 μ g/g)；
[0064]b、当检测带241不显示颜色，只有质控带242显现棕红色印迹，检测结果为阳性，表示被检测样品中马9?铃酸A含量超标(> 10 μ g/g)；
[0065]c、当检测带241和质控带242均不显色，则表明测试条已失效。