专利名称：：一种人前列腺特异抗原表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及遗传工程领域，特别涉及用基因重组的方法制备前列腺特异抗原表达载体，以及利用该表达载体生产人前列腺特异抗原的方法。二.技术背景前列腺特异抗原(prostatespecificantigen,PSA)是一种存在于精液中，由前列腺腺管和腺泡上皮细胞在雄性激素调控下分泌的一种丝氨酸蛋白酶，属于激肽释放酶家族成员，具有类胰凝乳蛋白酶、类胰蛋白酶和类脂酶活性。在血清中，总PSA(t-PSA)包括两种形式游离PSA(f-PSA)和f-PSA与a1-抗糜蛋白酶或a2-巨球蛋白形成的复合物(c-PSA)，半衰期很短。PSA的主要功能是水解精浆中来源于精囊、具有抑制精子活动功能的SemenogelinI、II和纤维连接蛋白，使精液发生液化，精子才能前向运动。天然人PSA由244个氨基酸组成，N端的氨基酸是异亮氨酸，C端的氮基酸是脯氨酸。这种含7%碳水化合物的单链糖蛋白由于有许多异构体，等电点较宽为pH6.87.2。由前列腺分泌的PSA最初呈酶原形式，无活性，其活化过程必须由精桨中的蛋白酶进一步修饰，切除其氨基端的前7个氨基酸，才能表现其活性状态。PSA有高度脏器特异性，是前列腺癌最主要的肿瘤标志物。PSA和前列腺癌的恶性程度及转移有关，浓度越高恶性度越高。血清PSA测定精确度高、稳定、重复性好，而且是无创的，这对前列腺癌的早期发现、治疗效果的评估、预后均有十分重要的意义。也可用于高危人群(50岁以上男性)前列腺癌的普查。目前，市面上出售的PSA多为进口，且多采用提取的方法获得。在精浆中，只有30%的PSA表现为具有分解蛋白的酶活性，5%与蛋白C抑制剂(PCI)结合，65M的PSA由于被精浆中其他蛋白酶切割消化而失去活性。用这种方法制备PSA，收率低，且成本非常高。故价格昂贵，每毫克PSA在4000元以上。而用基因工程的方法构建PSA表达体系，可以直接获得有活性、高收率的PSA，并大幅度降低制备成本。以往，PSA的体外表达多是在大肠杆菌中进行，但是在大肠杆菌中表达存在易形成包涵体、不能糖基化等问题，而且由于采用质粒表达，发酵过程需要添加昂贵的抗生素和IPTG等，大大提高了发酵成本。PSA是一种分泌性的糖蛋白，其氨基酸序列中有五个二硫键。大肠杆菌表达系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足，会影响翻译后PSA的正确折叠、糖基化，降低其生物活性。巴斯德毕赤酵母(尸化/w'apastor")是可以以甲醇作为唯一碳源的新型酵母表达系统(Ogata,K.,Nishikawa，H.andOhsugi，M.Ayeastcapableofutilizingmethanol.Agric.B毕赤巴斯德ol.chera.1969，33，1519-1520)。他带有编码醇氧化酶的两个基因，分别为A0X1和A0X2。细胞中AOXl的表达产物绝大部分具有醇氧化酶活性(Tsch叩p，J.F.，Brust，P.F.,Cregg，J".M.，Stillman，C.A.andGingeras，T.R.ExpressionoftheLacZgenefromtwomethanol—regulatedpromotersin/^'c/w'sjosstorz's.NucleicAxidsRes.1987,15,3859-3876)。典型的巴斯德毕赤酵母表达载体含有乙醇氧化酶基因5'A0X1启动子、3'A0X1终止子，这两段序列之间是供外源基因插入的多克隆酶切位点。通常以组氨酸脱氢酶基因(Histidinoldehydrogenase,HIS)基因HIS4作为营养互补型筛选标志或Zeocin及卡那霉素基因(kanamycin)赋予酵母的遗传霉素(G418)抗性作为筛选标志。作为一个能在大肠杆菌中繁殖、扩增的穿梭质粒，它还含有pBR322质粒的部分序列和氨苄青霉素(AmpR)抗性基因的筛选标志。表达载体通过同源重组整合到酵母细胞的染色体DNA中。巴斯德毕赤酵母表达体系具有下述独特优点酵母是低等真核生物，细胞生长快，易于培养；含特有的目前最强、调控机理最严格的启动子A0X1启动子，用甲醇可以严格地调控表达；表达质粒以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合在酵母基因组中，能够非常稳定地表达外源蛋白质，产量很高；表达的外源蛋白被正确折叠和加工并分泌到培养基中，而酵母本身只分泌少量蛋白，非常有利于产品的分离；对表达的外源蛋白进行信号序列的加工、蛋白质折叠、二硫键形成、某些脂质的加入、糖基化等翻译后的修饰，更接近哺乳动物细胞。三.
发明内容本发明的目的是提供一种人前列腺特异抗原表达载体。本发明所提供的人前列腺特异抗原表达载体，是含有人前列腺特异抗原基因和His-tag基因的巴斯德毕赤酵母表达载体。所述人前列腺特异抗原基因编码具有序列表中序列3的氨基酸残基序列。序列表中的序列3由237个氨基酸残基组成。所述人前列腺特异抗原基因可具有序列表中序列1的核苷酸序列，或与序列表中序列1的自5'端第114位至第824位碱基限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码序列3的氨基酸残基序列的核苷酸序列。序列表中的序列2由749个碱基组成，自5'端第4-10位碱基为EcoRI识别位点，第722-739位碱基为His-tag编码序列，第739-746位碱基为NotI识别位点。所述His-tag基因编码6个组氨酸残基。所述His-tag基因具有序列表中序列2的核苷酸序列。所述巴斯德毕赤酵母表达载体可为pPIC9K、pPIC3K。所述巴斯德毕赤酵母表达载体优选为pPIC9K。将所述人前列腺特异抗原基因和His-tag插入到pPIC9K的多克隆位点中的化o7PI和Abtl识别位点之间，构建得到pPIC9K-PSA。将上述人前列腺特异抗原表达载体导入巴斯德毕赤酵母细胞得到的重组细胞也属于本发明的范围。所述巴斯德毕赤酵母细胞可为巴斯德毕赤酵母GS115，腿71或SMD1168。所述巴斯德毕赤酵母优选为GS115。可利用电转化法将上述人前列腺特异抗原表达载体导入所述巴斯德毕赤酵母细胞。本发明的另一个目的是提供一种表达人前列腺特异抗原的方法。本发明所提供的表达人前列腺特异抗原的方法，包括培养上述重组巴斯德毕赤酵母细胞，甲醇诱导表达人前列腺特异抗原的步骤。上述表达人前列腺特异抗原的方法中，还包括利用金属亲和柱层析分离纯化所述人前列腺特异抗原的步骤。所述金属离子柱层析可为镍离子亲和层析。本发明的人前列腺特异抗原基因表达载体构建容易，并通过同源重组把人前列腺特异抗原基因整合入巴斯德毕赤酵母细胞的基因组中，稳定表达人前列腺特异抗原，避免了在大肠杆菌中表达该蛋白的折叠不正确、不能糖基化等问题，而且在发酵过程中无需使用昂贵的抗生素和IPTG，使生产成本大大降低。此外，巴斯德毕赤酵母的高密度生长，也有利于人前列腺特异抗原的表达，表达量可达1.8mg/ml，本发明具有重要的实际应用价值。四.附图1前列腺特异抗原毕赤酵母表达体系的构建流程图；附图2PSA基因的测序结果(5'端测序结果)；附图3PSA基因的测序结果(3'端测序结果)；附图4SDS-PAGE电泳图谱，左边为纯化前表达上清SDS-PAGE电泳图谱，右边为纯化后PSA的SDS-PAGE电泳图谱。五.具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用的酶如无特虽说明均来自TaKaRa公司。实施例1、人前列腺特异抗原巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K-PSA的构建如附图1所示，表达载体pPIC9K-PSA的构建步骤一、PSA基因的克隆及pMD18-simple-T-PSA载体的构建1、以购自Megaraan公司的cDNA文库为模板，用引物Pl，P2经PCR法合成5'端带feo《1酶切位点，3'端带AbfI酶切位点和His-tag编码序列的基因片段。弓I物P1:5'aa卿attcattgtgggaggctgggagtgcg卿a3，弓I物P2:5'tatgcggccgcatggtgatggtgatgatgggggttggccacgatggtgtcctt3'PCR反应体系无菌水14n110xExT叫Buffer2.5u110xMgCl22.5ul2.5raMdNTP110mMPI-5'引物lu110mMP2-3'引物ly1ExT叫0.125u1模板2y1PCR循环94°C5分钟变性；94。C30秒钟，55°C45秒钟，72°C1分钟，共35个循环；最后72。C延伸IO分钟。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，证明获得长度约为700bp的DNA扩增片段。2、PCR产物用小量DNA胶回收试剂盒(天根公司)将目的基因回收。将扩增的DNA片段用限制性内切酶^co7I和vVotl酶切后，与同样经^bo7I和Abtl酶切的pMD18-simple-T载体(购自TaKaRa公司)用T4DNA连接酶连接，得到pMD18-simple-T-PSA，具体操作参考TaKaRa公司pMD18-simple-TKit说明书。连接体系如下SolutionI5u1PCR产物4.5ii1pMD18-simple-T0.5y1vector64。C连接过夜。CaCl2法转化克隆菌株大肠杆菌感受态细胞DH5a，用含有50ug/ml氨苄的LB平板筛选转化子。阳性克隆抽取质粒用&o7lAVotl双酶切鉴定，操作方法参照《分子克隆指南》。二、人前列腺特异抗原巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K-PSA的构建鉴定正确的克隆，经限制性内切酶^bo/I/TfetI酶切过夜，与经同样限制性内切酶酶切的表达载体pPIC9K(Invitrogen公司)连接，转化大肠杆菌DH5a。用含50yg/ml氨苄青霉素的抗性LB平板进行筛选。阳性克隆接种于LB液体培养基37'C培养12-16小时，提取质粒，用fco///Abt/双酶切鉴定后，送去测序。经测序证明，结果与设计序列完全一致(测序结果见附图2，3)。质粒小量提取试剂盒(AXYGEN公司)提取质粒，得到人前列腺特异抗原巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K-PSA。实施例2、人前列腺特异抗原高拷贝菌株的筛选及诱导表达一、高拷贝阳性转化子表达菌株的筛选1、实施例1得到的pPIC9K-PSA，用内切酶线性化后，乙醇沉淀法得到线性化的质粒pPIC9K-PSA。2、线性化的质粒pPIC9K-PSA电转化巴斯德毕赤酵母1)将巴斯德毕赤酵母GS115划线于YPD—平板上，3(TC培养2-3天使其活化。挑取单克隆菌落接种于50mlYPD液体培养基中，3(TC培养至0De。。为1.3-1.5。2)将步骤l)的培养液，4°C3000rpm离心5分钟收集酵母细胞，弃上清。3)用等体积的灭菌水悬浮上述酵母细胞沉淀，4'C3000rpm离心5分钟收集酵母细胞，弃上清。4)重复步骤3)。5)用10ml1M山梨醇悬浮上述酵母细胞沉淀，4°C3000rpm离心5分钟收集酵母细胞。6)用100u11M山梨醇悬浮上述酵母细胞沉淀，得到100u1的电感受态酵母细胞。7)取5y1步骤1得到的线性化的pPIC9K-PSA和80y1的电感受态酵母细胞GS115混合后，置于冰上5分钟。转移到2咖电击杯中，在电压1.5KV进行电转化。78)取出电击杯。立即加入lml1M的山梨醇，转移到灭菌的1.5mlEppendorf管中，3(TC培养30分钟。9)取步骤8)的100ul菌液涂布于MD培养基，筛选阳性转化子，30'C培养2-3天，得到单克隆菌落。3、筛选人前列腺特异抗原的高拷贝阳性转化子表达菌株1)将MD培养基上生长的单克隆菌落用lmlYPD液体培养基悬浮，30。C培养1-2小时使其活化。2)分别取100u1上述菌液涂布于含终浓度为lmg/ml，2mg/ml，3mg/ml，4mg/mlG418的YPD平板，3(TC培养2-3天，得到单克隆菌落。根据培养平板上单克隆菌落的有无及多少来筛选高拷贝菌株，高浓度G418的YPD平板上生长的菌落为高拷贝转化子(见Invitrogen公司的Multi—Copy尸y乙'力iaExpressionKiti兑日月书)。3)选取一个PCR鉴定正确的高拷贝转化子克隆，300mlBMGY培养液中3(TC培养至0D6。。=2，500y1菌液内加入500u120%灭菌的甘油，保存于-80。C。剩余菌液3000rpm离心5分钟收集酵母细胞。4)加入BMMY培养液使OD,分别为0.5，1.0，1.5，每个不同菌体浓度的培养基分成三瓶，分别补充甲醇至终浓度0.5%，1.0%，1.5%。3(TC诱导表达72小时，每隔24小时取样lml，SDS-PAGE检测表达情况。在起始0D6。。=0.5，保持培养液pH7.0，甲醇浓度为1.0%的情况下，3CTC诱导72小时，重组PSA在毕赤酵母GS115中分泌表达量约为1.8mg/L,活性最高。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>二、人前列腺特异抗原的诱导表达培养基配方如下-BMGY(1L):蛋白胨20g酵母提取物10g1M磷酸钾缓冲液(Ri值6.0)100mlYNB13.4g500X生物素2ml50%甘油5mlBMMY(1L):蛋白胨20g酵母提取物10g1M磷酸钾缓冲液100mlYNB13.4g500X生物素2ml甲醇5ml从保存的菌种取50iU接种于BMGY培养基中，3(TC培养约30小时，无菌条件下，离心并更换BMMY，30'C继续培养约小时进行诱导表达。实施例3、人前列腺特异抗原的分离纯化1)实施例2的菌体培养液离心，表达上清液用PEG20000浓縮至100ml。在BalanceBuffer(成分为137rnMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2HP04，2mMKH2P04，pH7.4)中透析。2)透析后的表达上清液过High-AffinityNi-NTA柱(购自金思特公司)。预先用5倍柱体积的BalanceBuffer平衡层析柱。3)上样后，用BalanceBuffer洗至基线，而后用2倍柱体积的ElutionBuffer(成分为137mMNaCl'2.7函KCl，10mMNa2HP04，2mMKH2P04，250mM咪唑，pH7.4)洗脱，收集洗脱峰5ml。4)取2yg纯化好的蛋白质样品，变性12%SDS-PAGE电泳后用考马斯亮蓝染色，凝胶成像系统扫描分析，PSA呈分子量约为33KD的一条带，纯度大于90%(SDS-PAGE结果见附图4)。5)与购买的OEM公司的人源提取的PSA(2.76mgAnl)产品进行ELISA的活性比较，按本发明制备的PSA活性较高。加入抗原量02ng4ng8ng16ng32ng自产PSA0.0060.4430.7661.3251.7682.232OEM公司的PSA0.0080.3690.6081.2141.752.162本发明构建的PSA毕赤酵母真核表达体系可以稳定、高效的分泌表达有活性的重组蛋白。按本发明所述方法制备的重组PSA，培养上清液中累积的重组蛋白表达量高，可达1.8mg/ml。ELISA检测的灵敏性和活性明显好于市面上的同类产品。9序列表<110〉上海裕隆生物科技有限公司〈120〉一种人前列腺特异抗原表达载体及其应用<160〉5〈210〉1<211>1464〈212〉DNA〈213〉人属(Homo)<400>1agcccc犯gcttaccacctgC3CCCgg3g3gctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtct60tcctcaccctgtccgtgacgtggsttggtgctgcacccctcatcctgtctcggsttgtgg120g郷ctgggagtgcgsg犯gcatt:cccaaccctggcaggtgcttgtggcctctxgtggca180gggc已gtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgca240tcagg犯caa已agcgtga.tcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcct300gccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacg3ta_tgagcctcctga360agaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgt420cagagcctgccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccag480cactggggaccacctgctacgcctcaggctggggca,ttgaaccagaggagttcttga540acttcagtgtgtggacctccatgttatttcC肌tg3Cgtgtgtgcgcaag600ttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggca犯a660gcacctgctcgggtgattctgggggccca,cttgtctgtaatggtgtgcttcaaggt3tca720cgtcatggggcagtg犯ccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacacc犯ggtgg780tgcattaccgaaggacaccatcgtggccaacccctg邓ca840ccccctattggg犯ccttgggccaagactcaagcctcccc900agttctactgacctttgtccttaggtgtgaggt固gggttgctaggaaa960agacacaggtgtagaccag3gtgtttctta犯tggtgtaattttgtcctctctgtgtcct1020ggccatgcctggagac已t3tcactcaatttctctgaggac1080tggggtgtctgtgttatttgtggggtacag3gatg朋6LggLg鹏tgggatccacactgag1140卿gtgg卿gtg3C3tgtgctggacactgtccatgaagcactgagcagaagctggaggc12003gCMgg3tgtctgtcctgg1260aggcactggg昍gCCt3g3g卿gctgtgagcc鄉g郷g郷gtcttcctttggcatg1320ggatggggatgaagt卿gagagggactggaccccctggaagctgattcactatgggggg1380aggtgtattgaagtcctccagacaaccctcagatttgatgatttcctagt1440gctgttatactgtg1464<210>2〈211〉749<212>DNA〈213〉人属(Homo)<400>2aaagaattcaUgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgctt60gtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctc120acagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgttt180catcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctac240gatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccaxgacctc300atgctgctccgcctgtcagagcctgccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctg360cccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaa420ccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaat480gacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgc540tggacagggggca譜gcacctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggt600gtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttcc660ctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccc720taccactaccactactacgcggccgcata749<210〉3<211>237〈212〉PRT<213〉人属(Homo)〈400〉3lieValGly1ValValLysAspLeuAspAlaGluGlyLeuValAlaMsSerThrTyrAspGluProProValGlyAspSerLeuAlaGinlieGinMetSerThrLeuTrp5Ser20Trp35Leu50Val65Se80His95Asp110Gly125GluArgValLeuPheLeuAspAlaThrCysGlyLeuGlyGinLeuLeuValThrGluArgThrArgValLysMetLysCysLysHis10AlaVal25AlaAla40HisSer55SerHis70AsnArg85LeuLeu100ValMet115TyrAla130SerGinCysGlyHisCysLeuPheSerPhePheLeuArgLeuAspLeuSerGlyProTrpGin15GlyValLeu30lieArgAsn45HisProGlu60ProHisPro75ArgProGly90SerGluPro105ProThrGin120TrpGlySer135lieGluProGluGluPheLeuThrProLysLysLeuGinCysVal140145150AspLeuHisVallieSerAsnAspValCysAlaGinValHisPro155160165GinLysValThrLysPheMetLeuCysAlaGlyArgTrpThrGly170175180GlyLysSerThrCysSerGlyAspSerGlyGlyProLeuValCys185190195AsnGlyValLeuGinGlylieThrSerTrpGlySerGluProCys200205210AlaLeuProGluArgProSerLeuTyrThrLysValValHisTyr215220225ArgLysTrplieLysAspThrlieValAlaAsnPro230235237〈210〉4<211>35〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉<223〉根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作克隆含有人前列腺特异抗原基因和His-tag基因的DNA引物，命名为上游引物Pl。<400>4aaagaattcattgtgggaggctgggagtgcg卿a35〈210〉5<211〉53〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220><223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作克隆含有人前列腺特异抗原基因和His-tag基因的DNA引物，命名为下游引物P2。<■〉5tatgcggccgcatggtgatggtgatgatgggggttggccacgatggtgtcctt5'31权利要求1.一种人前列腺特异抗原表达载体，是转化了人前列腺特异抗原基因和His-tag基因的巴斯德毕赤酵母表达载体；所述巴斯德毕赤酵母表达载体为pPIC9K、pPIC3K。2.根据权利要求l所述的人前列腺特异抗原表达载体，其特征在于所述人前列腺特异抗原基因编码序列表中序列3氨基酸残基序列的蛋白质。3.根据权利要求2所述的人前列腺特异抗原表达载体，其特征在于所述人前列腺特异抗原基因为序列表中序列2的核苷酸序列。4.根据权利要求2所述的人前列腺特异抗原表达载体，特征在于所述人前列腺特异抗原表达载体为图1所示的pPIC9K-PSA。5.将权利要求1-4中任一所述的人前列腺特异抗原表达载体导入巴斯德毕赤酵母细胞得到的重组细胞。6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于所述巴斯德毕赤酵母细胞为巴斯德毕赤酵母GS115，KM71或SMD1168。7.—种表达人前列腺特异抗原的方法，包括培养权利5或6所述的重组巴斯德毕赤酵母，甲醇诱导表达人前列腺特异抗原的步骤。8.根据权利要求7所述的表达人前列腺特异抗原的方法，其特征在于所述方法中还包括利用金属亲和柱层析分离纯化人前列腺特异抗原的步骤。9.根据权利要求8所述的表达人前列腺特异抗原的方法，其特征在于所述金属亲和柱层析为镍离子亲和层析。全文摘要本发明公开了一种人前列腺特异抗原表达载体及其应用，目的是提供一种人前列腺特异抗原表达载体及导入该载体的重组酵母细胞，以及利用该重组细胞生产制备人前列腺特异抗原活性片断的方法。该表达载体是含有人前列腺特异抗原基因和His-tag基因的酵母表达载体。表达人前列腺特异抗原的方法，包括重组酵母细胞的构建，甲醇诱导表达及利用金属亲和层析分离纯化人前列腺特异抗原的步骤。本发明的人前列腺特异抗原表达载体通过同源重组使人前列腺特异抗原基因整合入酵母细胞基因组中，进行稳定表达，使生产成本大大降低。文档编号C12N15/81GK101659963SQ200810042300公开日2010年3月3日申请日期2008年8月29日优先权日2008年8月29日发明者纲刘,汪宁梅,穆海东申请人:上海裕隆生物科技有限公司