专利名称：前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白复合物，特别涉及前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合 物，还涉及该复合物的制备方法和应用。
背景技术：
前列腺癌是西方国家常见的肿瘤，居男性肿瘤死亡原因第二位。尽管最近在诊 断和治疗局限性前列腺癌方面有了一些进展，但仍有许多问题亟待解决，如诊断方法缺乏 特异性，不能准确区分静止性和进展性的前列腺癌，难以对病人预后进行预测，约20% 40%的患者经过手术和放射治疗后复发等。尽管雄激素阻断疗法可以使一部分患者的病情 得到缓解，但是大部分患者还是不可避免地发展到目前无法治疗的雄激素非依赖性病变。 因此，发展诊断和治疗前列腺癌的新方法及新药物成为目前研究的焦点。前列腺干细胞抗原(prostatestem cell antigen, PSCA)是 Reiter 等于 1998 年 利用特征性差异分析法在前列腺癌细胞株中发现的一种前列腺癌相关肿瘤抗原，具有高度 的前列腺特异性，在多数前列腺癌中均有高表达，尤其在前列腺癌骨转移肿瘤中呈100%强 表达，而在其他正常组织很少表达，其单克隆抗体在动物实验中能有效抑制雄激素依赖及 非依赖性前列腺癌的生长。PSCA是一种细胞膜抗原，为含有123个氨基酸的糖蛋白，氨基端 为信号序列，羧基端为糖化磷脂酰肌醇(GPI)锚定序列，中间有多个糖基化位点。其与干细 胞抗原2(SCA-2)有30%的同源性，后者是依赖于GPI锚定细胞表面的Thy21/Ly26家族抗 原成员之一。同干细胞抗原一样，PSCA也依赖GPI结合于细胞膜上，并可被GPI特异性磷 酸酯酶所清除。研究发现，识别PSCA的细胞毒性T细胞(CTL)可以在患者外周血中提取得 到，其可以溶解杀伤前列腺癌细胞。因此，PSCA可以作为T细胞介导的前列腺癌免疫治疗 中的靶抗原，通过激活识别PSCA的CTL特异性杀伤癌细胞。热休克蛋白(HSP)是一类广泛存在于生物体内高度保守的蛋白质，在高温、创伤、 感染、缺氧、重金属中毒、氧自由基及恶性肿瘤等应激状态下可诱导表达。HSP具有“分子 伴侣”作用，在正常状态下，参与细胞内各种新生肽链的结合、装配和跨膜转运；在应激状态 下，可与细胞内变性的蛋白质结合，协助其复性或将其运送至溶酶体降解以维持细胞的正 常生命代谢。许多研究结果证实，从肿瘤组织中提取的HSP可以诱导机体产生针对该肿瘤 的免疫应答，达到治疗肿瘤的目的。进一步研究表明，从肿瘤组织中提取的HSP实际为抗原 肽-HSP复合物，其可通过以下几方面诱导机体的抗肿瘤免疫(1)抗原肽-HSP复合物作为 完整抗原，被抗原递呈细胞摄取、加工后，与主要组织相容性复合体(MHC)结合并递呈到细 胞表面，从而活化T细胞，包括CD4+和CD8+T细胞，特别是CTL，产生抗肿瘤的特异性细胞免 疫；HSP在此处起到载体或佐剂的作用，诱导免疫应答的是其结合的抗原多肽；(2) HSP本身 具有活化巨噬细胞和树突状细胞的作用，从而增加共刺激因子和MHC的表达，加强机体的 抗肿瘤免疫；(3)自然杀伤细胞和Y δ T细胞是体内重要的抗肿瘤免疫细胞，对肿瘤细胞的 杀伤效应不受MHC的限制，HSP可直接作为抗原递呈分子，将抗原肽递呈至细胞表面，从而
3活化自然杀伤细胞和Y S T细胞，产生抗肿瘤的非特异性免疫。根据分子量大小和氨基酸 序列同源性的不同，HSP可以分为HSPllO家族、HSP90家族(83 90kD)、HSP70家族(66 78kD)、HSP60家族及小HSP家族(15 39kD)。其中，HSP70家族在细胞内含量最多，有20 余个成员，广泛存在于细胞内不同部位。HSP70在进化上具有高度的保守性，其氨基端有 ATP结合区并具有ATP酶活性，较羧基端具有更高的保守性，而羧基端是结合多肽或特殊蛋 白的部位，具有易变性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种PSCA与HSP的复合物，能够激活识别 PSCA的特异性CTL，诱导强有力的抗前列腺癌免疫，且不需要任何佐剂，在同种间应用不受 MHC的限制；目的之二在于提供所述PSCA与HSP的复合物的制备方法；目的之三在于提供 所述PSCA与HSP的复合物在医药方面的应用。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案1、PSCA与HSP的复合物，由PSCA与HSP70以非共价键结合而成，所述PSCA具有 SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列，HSP70具有SEQ ID No. 8所示的氨基酸序列。进一步，由PSCA与HSP70以摩尔比为1 1结合而成。2、所述PSCA与HSP的复合物的制备方法，是在浓度为0. 01mol/L、pH为7. 2 7. 4 的磷酸盐缓冲液即PBS中，分别加入PSCA与HSP70，混合均勻，43°C孵育30分钟，再37°C孵 育1小时，即得PSCA与HSP70的复合物。进一步，按摩尔比为1 1加入PSCA和HSP70，使PSCA和HSP70在PBS中的浓度 均为3 6 μ g/mLo3、所述PSCA与HSP的复合物在制备抗前列腺癌疫苗中的应用。本发明的有益效果在于本发明提供的PSCA与HSP的复合物，能够激活识别PSCA 的特异性CTL，诱导强有力的抗前列腺癌免疫；PSCA中包含MHC I类和II类分子的多个表 位，可以激发广谱的⑶8+和⑶4+T细胞，还包含T细胞和B细胞表位，可以激发T细胞和 B细胞的抗肿瘤应答；由于HSP结构上的高度保守，不具有多态性，在同种内相互使用不受 MHC的限制；HSP具有免疫佐剂的作用，省略了常规蛋白免疫需要免疫佐剂的麻烦；该复合 物的制备方法简单，可以用于制备抗前列腺癌疫苗，在前列腺癌免疫治疗领域有着良好的 开发应用前景。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述，其中图1为蛋白免疫印迹(Western Blot)鉴定PSCA ；图 2 为 Western Blot 鉴定 HSP70 ；图 3 为 Western Blot 鉴定 PSCA-HSP70 复合物；图4为酶联免疫斑点(ELISP0T)法检测PSCA-HSP70复合物激发CTL分泌IFN- γ 的能力；图5为51Cr释放法检测PSCA-HSP70复合物激发CTL对结肠癌细胞CT26的特异性杀伤效应。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克 等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。一、PSCA-HSP70复合物的制备1、PSCA 的制备(I)PSCA cDNA 全长的克隆根据GenBank登录号为NM_005672的PSCA基因序列，设计并合成如下引物以扩增 PSCA cDNA 全长:F1 :5，-atgaaggctgtgctgcttgccctgt-3，(SEQ ID No. 3) ,Rl :5，-cgagctg gccgggtccccagagc-3，(SEQ ID No. 4)；提取前列腺癌细胞 LNCaP 的总 RNA，逆转录为 cDNA， 再以该cDNA为模板、Fl和Rl为上下游引物进行PCR扩增，PCR条件为94°C预变性3分 钟，然后94°C变性30秒、56°C退火30秒，72°C延伸30秒，共30个循环，最后72°C延伸5分 钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与克隆载体pGEM-T Easy连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳 性克隆，提取阳性克隆质粒，委托上海生工公司测定质粒序列，将插入了 PSCA cDNA全长序 列(SEQ ID No. 1)的阳性克隆质粒命名为pGEM-PSCA。(2) PSCA基因重组真核表达载体的构建根据PSCA cDNA全长序列和真核表达载体pcDNA3. 1的多克隆位点，设计并合成如 下引物以扩增两端带有酶切位点的PSCA cDNA全长F2 ^'-ccggtaccatgaaggctgtgctgctt gccctgt-3，(SEQ ID No. 5)，下划线部分为 Kpn I 酶切位点；R2 ^'-cctctagacgagctggccgg gtccccagagc-3’(SEQ ID No. 6)，下划线部分为Xba I酶切位点；以质粒pGEM-PSCA为模板、 Fl和Rl为上下游引物进行PCR扩增，PCR条件与步骤(1)相同；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳 鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，用Kpn I和Xba I进行双酶切，双酶切产物经凝胶 回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经Kpn I和Xba I双酶切的真核表达载体pcDNA3. 1在 T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用含有氨苄青 霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，用Kpn I和Xba I进行双酶切鉴定，并委 托上海生工公司测定质粒序列，将插入了 PSCA cDNA全长序列的阳性克隆质粒命名为PSCA 基因重组真核表达载体pcDNA3. 1-PSCA。(3) PSCA基因工程菌的构建将PSCA基因重组真核表达载体pcDNA3. I-PSCA用Sal I酶切使线性化，用电穿 孔法转化毕赤酵母GSl 15感受态细胞，转化产物涂布于MD平板，30°C培养3 4天，挑取 白色酵母菌落，分别点接于MD和匪平板，30°C培养3 6天(每天向匪平板中添加甲醇 100 μ L)，挑取MD平板上生长明显快于匪平板的酵母菌落，点接于含有浓度为4mg/mL的 G418的YPD平板，30°C培养7天，所得酵母菌即为高拷贝PSCA基因工程菌。(4) PSCA的诱导表达将高拷贝PSCA基因工程菌于30°C培养至0D600为2，按10%接种量接入BMGY培 养基中，30°C培养24小时，5000g离心5分钟，弃上清，细菌沉淀用无菌水洗涤2次，重悬于
5等体积的BMMY培养基中，30°C诱导表达3天(每24小时补加诱导剂甲醇至最终体积百分浓 度为0. 5% )，4°C、6000g离心5分钟，收集上清，加入质量百分浓度为80%的硫酸铵溶液使 蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0. 02mol/L、pH为8.0的磷酸盐缓冲液(PBS) 透析脱盐，再用琼脂糖凝胶(Q-Sepharose)柱进行分离纯化，用浓度为lmol/L的氯化钠溶 液线性梯度洗脱，收集含有PSCA的洗脱液，适当浓缩后用葡聚糖凝胶(S印hdexG-25)柱脱 盐，即得纯化的PSCA (序列如SEQ ID No. 2所示)。Western Blot鉴定取纯化的PSCA，加入内参β-actin和上样缓冲液，100 °C 加热3 5分钟，用质量百分浓度为12%的分离胶、质量百分浓度为5%的积层胶进行 SDS-PAGE，电泳完毕后，将分离产物电转移至PVDF膜上，用质量百分浓度为5%的脱脂奶粉 溶液封膜，加入鼠抗人PSCA单克隆抗体和鼠抗人β -actin单克隆抗体，温度37°C孵育1小 时，洗膜，再加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，温度37°C孵育1小时，洗膜，显色；同时 设置阴性对照(不加入纯化的PSCA)；结果见图1，其中1泳道为纯化的PSCA，2泳道为阴 性对照，可见1泳道除内参β -actin条带外，还有一明显的蛋白条带，而2泳道未见相应条
市ο2、HSP70 的制备(1) HSP7OcDNA 全长的克隆根据GenBank登录号为NM 005345的HSP70基因序列和酵母表达载体pRSET_A的 多克隆位点，设计并合成如下引物以扩增两端带有酶切位点的HSP70cDNA全长F3 :5’tt￡g atccatgtccaagggacctgca-3‘ (SEQ ID No. 9)，下划线部分为 BamH I 酶切位点；R3 :5，_gg巡 atRRttaatcaacctcttcaat-3’ (SEQ ID No. 10)，下划线部分为 Nco I 酶切位点；提取 IfepG2 细胞的总RNA，逆转录为cDNA，再以该cDNA为模板、F3和R3为上下游引物进行PCR扩增， PCR条件为94°C预变性4分钟，然后94°C变性30秒、58°C退火30秒，72°C延伸2. 5分钟， 共30个循环，最后72°C延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用凝胶回收试剂 盒进行切胶回收纯化。(2)HSP70基因重组酵母表达载体的构建将纯化的PCR产物用BamH I和Nco I进行双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒 切胶回收纯化后，与同样经BamH I和Nco I双酶切的酵母表达载体pRSET_A在T4DNA连接 酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB 平板筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，用BamH I和Nco I进行双酶切鉴定，并委托上海生 工公司测定质粒序列，将插入了 HSP70cDNA全长序列(SEQ ID No. 7)的阳性克隆质粒命名 为HSP70基因重组酵母表达载体pRSET-HSP70。(3)HSP70基因工程菌的制备将HSP70基因重组酵母表达载体pRSET-HSP70用Sal I酶切使线性化，用电穿孔法 转化毕赤酵母GS115感受态细胞，转化产物涂布于MD平板，30°C培养3 4天，挑取白色酵 母菌落，分别点接于MD和匪平板，30°C培养3 6天(每天向匪平板中添加甲醇100 μ L)， 挑取MD平板上生长明显快于匪平板的酵母菌落，点接于含有浓度为4mg/mL的G418的YPD 平板，30°C培养7天，所得酵母菌即为高拷贝HSP70基因工程菌。(4)HSP70的诱导表达将高拷贝HSP70基因工程菌于30°C培养至0D600为2，按10%接种量接入BMGY培养基中，30°C培养24小时，5000g离心5分钟，弃上清，菌体用无菌水洗涤2次后，重悬于 等体积的BMMY培养基中，30°C诱导表达3天(每24小时补加诱导剂甲醇至最终体积百分 浓度为0. 5% )，4°C、6000g离心5分钟，收集上清，加入质量百分浓度为80%的硫酸铵溶液 使蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0. 02mol/L、pH为8. 0的PBS透析脱盐， 再用Q-Sepharose柱进行分离纯化，用浓度为lmol/L的氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集含 有HSP70的洗脱液，适当浓缩后用S印hdex G-25柱脱盐，即得纯化的HSP70(序列如SEQID No. 8所示)。Western Blot鉴定取纯化的HSP70，加入内参β-actin和上样缓冲液，100°C 加热3 5分钟，用质量百分浓度为12%的分离胶、质量百分浓度为5%的积层胶进行 SDS-PAGE，电泳完毕后，将分离产物电转移至PVDF膜上，用质量百分浓度为5%的脱脂奶粉 溶液封膜，加入鼠抗人HSP70单克隆抗体和鼠抗人β -actin单克隆抗体，温度37°C孵育1 小时，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，温度37°C孵育1小时，洗膜，显色；同时 设置阴性对照(不加入纯化的HSP70)；结果见图2，其中1泳道为纯化的HSP70，2泳道为阴 性对照，可见1泳道除内参β-actin条带外，还有一明显的蛋白条带，而2泳道未见相应条
市ο3、PSCA_HSP70复合物的制备在浓度为0. 01mol/L、pH为7. 2 7. 4的PBS (由浓度为137mmol/L的NaCl、浓度 为 2. 7mmol/L 的 KCl、浓度为 4. 3mmol/L 的 Na2HPO4 和浓度为 1. 4mmol/L 的 KH2PO4 组成)中， 按摩尔比为1 1加入纯化的PSCA和HSP70，使PSCA和HSP70在PBS中的浓度均为3 6 μ g/mL,混合均勻，43°C孵育30分钟，再37°C孵育1小时，即得PSCA-HSP70复合物。Western Blot鉴定取PSCA-HSP70复合物，冰上勻浆裂解30分钟，加入鼠抗人 HSP70单克隆抗体，4°C漩涡混合过夜，加入IgG Beads，4°C漩涡混合5小时，4°C、5000r/min 离心10分钟，收集上清，加入内参β -actin和上样缓冲液，95°C加热5分钟，用质量百分浓 度为12%的分离胶、质量百分浓度为5%的积层胶进行SDS-PAGE，电泳完毕后，将分离产物 电转移至PVDF膜上，用质量百分浓度为5 %的脱脂奶粉溶液封膜，加入鼠抗人PSCA单克隆 抗体和鼠抗人β -actin单克隆抗体，温度37°C孵育1小时，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记 的兔抗鼠IgG，温度37°C孵育1小时，洗膜，显色；同时设置阴性对照(不加入PSCA-HSP70 复合物)；结果见图3，其中1泳道为PSCA-HSP70复合物，2泳道为阴性对照，可见1泳道除 内参β -actin条带外，还有一明显的蛋白条带，而2泳道未见相应条带。二、PSCA-HSP70复合物的抗肿瘤活性研究效应细胞的制备将30只6 8周龄雌性Babl/c小鼠随机分为3组实验组、对 照组和空白组，每组10只；将PSCA-HSP70复合物和0VA-HSP70复合物(卵清蛋白与HSP70 按前述步骤3方法制得的复合物)分别用浓度为0. lmol/L、pH为7. 4的PBS溶解制成浓度 为0. 5mg/mL的溶液；实验组以浓度为0. 5mg/mL的PSCA-HSP70复合物溶液为免疫原，对照 组以浓度为0. 5mg/mL的0VA-HSP70复合物溶液为免疫原，空白组以浓度为0. lmol/L、pH为 7. 4的PBS为免疫原；各组于小鼠背侧尾根部皮下注射免疫原，每只100 μ L，之后每间隔1 周，以同样方法加强免疫1次，共免疫3次；末次免疫后1周，断颈处死小鼠，在无菌条件下 取脾脏，用100目筛网碾磨，收集细胞悬液，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分 离脾淋巴细胞，用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI1640培养基调节细胞密度为1 X IO6个/mL，作为后续实验的效应细胞。1、ELISP0T法检测PSCA-HSP70复合物激发CTL分泌IFN- γ的能力采用ELISP0T检测试剂盒进行检测，具体操作参照试剂盒说明书在96孔培养 板中，每孔加入体积百分浓度为70%的乙醇100 μ L，室温放置10分钟，PBS洗涤，再加入 IFN-Y捕获抗体(稀释度为1 100) 100 μ L，温度4°C孵育过夜，PBS洗涤，再加入质量百 分浓度为2%的脱脂奶粉溶液100 μ L，室温封闭2小时，PBS洗涤，再加入效应细胞100 μ L， 温度37°C孵育48小时，PBST(即含有质量百分浓度为0. 的吐温20的PBS)洗涤，再加 入生物素标记的抗IFN- γ抗体(稀释度为1 100) 100 μ L，温度37°C孵育1. 5小时，PBST 洗涤，再加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(稀释度为1 5000) 10(^1^，温度371孵育1 小时，PBST洗涤，拍干培养板，再加入即用型BCIP/NBT底物反应液100 μ L，室温避光显色 2 10分钟至斑点形成，用蒸馏水终止反应，干燥后检测斑点数；同时设置阴性对照组(不 加入效应细胞)，各组斑点数以3个复孔的均值表示。结果见图4，实验组的斑点数(235个/IO5细胞)明显高于其它3组(对照组为 149个/IO5细胞，空白组为10个/IO5细胞，阴性对照组为3个/IO5细胞)，表明本发明的 PSCA-HSP70复合物具有良好的免疫原性，能够有效激发CTL分泌IFN- γ。2,51Cr释放法检测PSCA-HSP70复合物激发CTL对肿瘤细胞的特异性杀伤效应靶细胞的制备将结肠癌细胞CT26用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的 RPMI 1640培养基进行培养，收集细胞，离心洗涤2次后，用含有质量百分浓度为10%的胎 牛血清的RPMI 1640培养基调节细胞密度为IX IO6个/mL，取ImL置IOmL血清瓶中，加入 100 μ Ci Na51CrO4，温度37°C孵育90分钟，充分洗涤细胞除去未结合的51Cr,再用含有质量 百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI1640培养基调整细胞密度为1 X IO5个/mL，作为靶细 胞。在96孔U型板中，每孔分别按效靶比(E/T)为100 1、50 1和25 1加入效 应细胞与靶细胞，每种效靶比设3个复孔，同时设最大释放组(用浓度为2mol/L的盐酸替 代效应细胞)和最小释放组(用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基 替代效应细胞)；将96孔板500r/min离心30秒后，温度37°C孵育4小时，1000r/min离心 10分钟，各孔取上清100 μ L，用γ计数器测定每分钟放射活性(cpm值)，按下述公式计算 杀伤率杀伤率(％)=[(实验组cpm均值-最小释放组cpm均值)/ (最大释放组cpm均 值_最小释放组cpm均值)]X 100%,杀伤率大于15%判为特异性杀伤。结果见图5，实验组在各效靶比对CT26细胞均有特异性杀伤作用，且随着效靶比 增大，特异性杀伤作用逐渐增强，当E/T为100 1时，杀伤率为51.7%，而对照组和空白组 对CT26细胞无特异性杀伤作用，表明本发明的PSCA-HSP70复合物能够有效激发CTL产生 对肿瘤细胞的特异性杀伤效应。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。序列表<110>中国人民解放军第三军医大学
8<120>前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合物及其制备方法和应用
<160>10
<210>1
<211>372
<212>DNA<213>智人(homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>⑴…..(372)
<400>1
acgaaggctgtgctgcttgccctgttgatggcaggcttggccctgcagccaggcactgcc60
ctgctgtgctactcctgcaaagcccaggtgagcaacgaggactgcctgcaggtggagaac120
tgcacccagctgggggagcagtgctggaccgcgcgcatccgcgcagttggcctcctgacc180
gtcatcagcaaaggctgcagcttgaactgcgtggatgactcacaggactactacgtgggc240
aagaagaacatcacgtgctgtgacaccgacttgtgcaacgccagcggggcccatgccctg300
cagccggctgctgccatccttgcgctgctccctgcactcggcctgctgctctggggaccc360
ggccagctctag372
<210>2
<211>123
<212>PRT
<213> 智人(homo
<400>2
sapiens)
Met Lys Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu 15
Gln Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr 20
Ser Asn Glu Asp Cys Leu Gln Val Glu 35
Glu Gln Cys Trp Thr Ala Arg lie Arg 50
Val lie Ser Lys Gly Cys Ser Leu Asn 65
Asp Tyr Tyr Val Gly 80
Leu Cys Asn Ala Ser 95
lie Leu Ala Leu Leu Pro Ala Leu Gly 110
Gly Gln Leu
Lys Lys Asn lie Gly Ala His Ala
Met Ala Gly Leu Ala Leu 1015
Ser Cys Lys Ala Gln Val 2530
Asn Cys Thr Gln Leu Gly 4045
Ala Val Gly Leu Leu Thr 5560
Cys Val Asp Asp Ser Gln 7075
Thr Cys Cys Asp Thr Asp 8590
Leu Gln Pro Ala Ala Ala 100105
Leu Leu Leu Trp Gly Pro 1151200095]<210>3
0096]<211>25
0097]<212>DNA
0098]<213>人工序列
0099]<220>
0100]<223> 引物 Fl
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0123]<220>
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0125]<400>6
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0130]<213> 智人(homo sapiens)
0131]<220>
0132]<221>CDS
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Leu Phe Val His Gln Ser Ala Leu Gly Thr Gly Asp Ala Ala Lys Lys Ala Leu Gly Asp
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Gly 290 Leu 305 Ala 320 Val 335 Leu 350 Pro 365 Leu 380 Asp 395 Met 410 Thr 425 lie 440 Leu 455 Gly 470 lie 485 Lys 500 lie 515 Glu 530 Tyr 545 Gly 560 Gln
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Phe Asp Asp Gly Phe Ala Asp Pro Leu Phe Tyr Arg Gln Val lie Met Arg Asn Ser lie
Tyr Leu Ala Gly Phe Val Lys Leu lie Thr Glu Phe lie Thr Thr Val Glu Met Glu Ser
Thr 295 Phe 310 Lys 325 Ser 340 Asn 355 Ala 370 Ser 385 Ser 400 Lys 415 Thr 430 Gly 445 Glu 460 Glu 475 Ala 490 Asn 505 Gln 520 Arg 535 Lys 550 Ala 565 Trp
Ser Arg Leu Thr Gly Tyr Glu Leu Arg Tyr Glu Leu Val Thr Asp Glu Val Ser Asp Leu
lie Ser Asp Arg Arg Gly Asn Gly Asn Ser Arg Ser Thr Asp Lys Ala Ser Ala Lys Asp
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Arg Leu Ala Pro Leu Ala Gln Glu Thr Asn Met lie Asp Ser Arg Lys Lys Glu Lys Asn
Ala 300 Glu 315 Gln 330 Lys 345 Asn 360 Val 375 Asp 390 Thr 405 lie 420 Gln 435 Thr 450 Pro 465 lie 480 Thr 495 Leu 510 Tyr 525 Asn 540 Asp 555 Val 570 Thr
575580585
Leu Ala Glu LysAsp GluPhe Glu His Lys ArgLysGluLeuGlu
590595600
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<212>DNA
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<400>10
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1权利要求
前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合物，其特征在于由前列腺干细胞抗原与热休克蛋白70以非共价键结合而成，所述前列腺干细胞抗原具有SEQID No.2所示的氨基酸序列，热休克蛋白70具有SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合物，其特征在于由 前列腺干细胞抗原与热休克蛋白70以摩尔比为1 1结合而成。
3.权利要求1所述前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合物的制备方法，其特征在 于在浓度为0. 01mol/L、pH为7. 2 7. 4的磷酸盐缓冲液即PBS中，分别加入前列腺干细 胞抗原和热休克蛋白70，混合均勻，43°C孵育30分钟，再37°C孵育1小时，即得前列腺干细 胞抗原与热休克蛋白的复合物。
4.根据权利要求3所述前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合物的制备方法，其特征 在于按摩尔比为1 1加入前列腺干细胞抗原和热休克蛋白70，使前列腺干细胞抗原和 热休克蛋白70在PBS中的浓度均为3 6 μ g/mL。
5.权利要求1所述的前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合物在制备抗前列腺癌疫 苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合物及其制备方法和应用，该复合物由前列腺干细胞抗原与热休克蛋白70以非共价键结合而成，能够激活特异性CTL，诱导强有力的抗前列腺癌免疫，且不需要任何佐剂，在同种间应用不受MHC的限制；同时，前列腺干细胞抗原中包含MHC I类和II类分子的多个表位，可以激发广谱的CD8+和CD4+T细胞，还包含T细胞和B细胞表位，可以激发T细胞和B细胞的抗肿瘤应答；该复合物的制备方法简单，可以用于制备抗前列腺癌疫苗，在前列腺癌免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。
文档编号A61K47/42GK101912603SQ20091025105
公开日2010年12月15日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月29日
发明者吴玉章, 杨曌 申请人:中国人民解放军第三军医大学