己酰甘氨酸作为增重和肥胖倾向的生物标志物的制作方法
【专利说明】己酰甘氨酸作为增重和肥胖倾向的生物标志物
[0001]本发明一般地涉及营养和健康领域。特别地，本发明涉及新生物标志物、其用途和允许其诊断抵抗饮食诱导的增重，和/或易受饮食诱导的增重的可能性的方法。例如，生物标志物可以是己酰甘氨酸。此生物标志物也可用于诊断/监测生活方式改变对对象中增重风险的影响。
[0002]肥胖已经成为21世纪中最重要的全球性健康问题，因为其升高了患其他疾病，包括2型糖尿病、肝性脂肪变性(NAFLD)、癌症、关节炎和心血管疾病(CVD)的风险。肥胖的病因学来自遗传和环境因素诸如高热量饮食、缺乏体力活动和行为的复杂相互作用。参与多种生理功能诸如肠道先天免疫系统的成熟和养分的消化/吸收的肠道微生物群也影响了若干种代谢疾病的发展并且似乎对肥胖具有显著的影响。因此，发生肥胖的个体倾向根据这些多因素原因而不同。
[0003]摄入富含脂肪和/或碳水化合物的不平衡饮食已经与脂肪组织以及瘦组织诸如肝、肌肉和心脏中的增加的甘油三酯贮藏速率相关联。此异位脂肪沉积诱导性脂毒性也与多种代谢病症诸如高甘油三酯血症、高血压、高空腹血糖和胰岛素抵抗(IR)相关联。然而，一些超重或肥胖人可能发展出多种代谢病症而其他人保持健康。例如，身体中脂肪沉积的定位影响代谢病症的发展。已经将足以释放致动脉粥样硬化的脂连蛋白并处理脂肪酸的心外膜脂肪明确地与人中CVD标志物相关联。相比较之下，已经将肝内脂肪与炎症和胰岛素抵抗相关联。Wildman等人也突出了健康中年女性中的种族与族群差异与内脏和皮下脂肪组织的差别的代谢活性相关联，这能影响发展出肥胖和CVD的族群相关的倾向。因此，在早期阶段鉴定出发展肥胖相关的代谢病症的可能性，以评价个体代谢状态和有效地预防代谢疾病的发展是相关的。
[0004]因此为本领域提供允许早期-理想地在其增重之前-鉴定当消耗富含脂肪的饮食时很可能增重的对象的方法将是合乎期望的。
[0005]本说明书中对现有技术文件的任何参考不应被认为是承认此类现有技术是广泛已知的或形成本领域中普通一般知识的一部分。
[0006]本发明的目的是提高本领域技术并且特别地是提供允许在早期有效地将人们分层为其是否很可能响应高脂肪饮食而增重的方法。
[0007]本发明人惊讶地发现本发明的目的能够通过独立权利要求的主题实现。从属权利要求进一步发展了本发明的观点。
[0008]因此，本发明提供了生物标志物，其用途和诊断抵抗高脂肪饮食诱导的增重的可能性的方法。
[0009]如本说明书中所用，词语“包含”，“含有”，和相似的词语不应以排他性或穷尽性含义解释。换言之，其旨在意为“包括，但不限于”。
[0010]本发明人已经使用了代谢组学方法以实现本发明的目的。代谢组学在今天被认为是表征代谢表型的完善建立的系统方法，其包含多种因素诸如环境、药物、饮食、生活方式、遗传学，和微生物组因素的影响。与提示生理学变化的可能性的基因表达和蛋白质组数据不同，代谢物及其在细胞、组织和器官内的动态浓度改变，代表了生理调控过程的真正终点。
[0011]因此，研宄与多种饮食性干预和疾病发展关联的逐渐的代谢改变是合适的方法。最近，基于代谢组学和脂类组学的发现已经加速了我们对疾病过程的理解，并且将提供用于与代谢综合征相关联的亚临床病症的预防和营养管理的新途径。“组学”数据已经突出了能量代谢(Krebs循环)、脂类和氨基酸加工，以及炎性信号对肥胖和IR发作的贡献。
[0012]使用随时间收集的尿样品的质子核磁共振(1H NMR)光谱学和增重监控的组合，本发明人已经在良好定义的C57BL/6J小鼠模型中鉴定了由高脂肪饮食诱导的逐渐增重的新的代谢生物标志物。公知此动物模型在同基因动物中显示极端表型，即抵抗或倾向于高脂肪诱导的增重分布的动物。本发明人已经表征了用高脂肪饮食(HFD)饲喂的C57BL/6小鼠的短期(7天)和长期(60天)代谢适应并且已经建立了与HFD饲喂的小鼠(即抵抗或倾向于高脂肪诱导的增重的动物)中的表型变异性相关联的具体代谢标志。通过使用代谢组学方法，发明人已经显示线粒体代谢途径(脂肪酸β氧化、支链氨基酸分解代谢、丁酸代谢、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸途径和Krebs循环)由高脂肪饲喂快速上调，这可能反映线粒体的脂肪酸饱和以及能量代谢的损害。
[0013]发明人能够显示在HFD下肥胖抗性的小鼠与线粒体氧化途径(β氧化、丁酸代谢和亮氨酸分解代谢)的具体激活相关联，所述激活可能是针对脂肪酸过载的保护性机制。
[0014]这些结果强调了线粒体在肥胖发展中的作用并允许得出这样的结论，S卩，使用发明人已经鉴定的具体的生物标志物组，能够从早期代谢标志测定发展代谢病症，诸如肥胖的可能性。
[0015]发明人能够显示在高脂肪饲喂一周后(第7天)的尿代谢响应使得不仅能预测每个个体的最终增重(第60天)，还能够根据其抵抗或倾向于高脂肪诱导的增重的倾向而对动物分层。
[0016]因此，本发明涉及新的生物标志物己酰甘氨酸。
[0017]本发明还涉及己酰甘氨酸作为尿中用于检测和/或定量抵抗高脂肪饮食诱导的增重的可能性的生物标志物的用途。相似地，本发明还涉及己酰甘氨酸作为尿中用于检测和/或定量易受高脂肪饮食诱导的增重的可能性的生物标志物的用途。
[0018]本发明还涉及诊断受试者中抵抗高脂肪饮食诱导的增重的可能性的方法，所述方法包括测定先前从待测试的受试者获得的尿样品中己酰甘氨酸的水平，和比较受试者的己酰甘氨酸水平与预测定的参照值，其中预测定的参照值是基于对照群体中尿中的平均己酰甘氨酸水平，并且其中较之预测定的参照值样品中增加的己酰甘氨酸水平表明抵抗高脂肪饮食诱导的增重的增加的可能性。相似地，本发明也涉及诊断受试者中易受高脂肪饮食诱导的增重的可能性的方法，所述方法包括测定先前从待测试的受试者获得尿样品中己酰甘氨酸的水平，并比较受试者的己酰甘氨酸水平与预测定的参照值，其中预测定的参照值是基于对照群体中尿中的平均己酰甘氨酸水平，并且其中较之预测定的参照值样品中降低的己酰甘氨酸水平或没有改变提示易受高脂肪饮食诱导的增重的增加的可能性。
[0019]本发明的此生物标志物也可用于诊断和/或监测生活方式的改变对受试者中增重风险的影响。对于此，可以在生活方式改变之前测定生物标志物水平并且在生活方式改变之后将获得的水平可以与所述生物标志物的水平比较。
[0020]图1:在饲喂HFD的η = 56只小鼠的群体中身体增重的变异性。(A)实验设计。(B) 7天和60天HFD饲喂后小鼠的体重分布。(C)在每个时间点鉴定对肥胖非响应者(NR)和强响应者(SR)小鼠。在2个时间点或在实验的整个过程中观察若干NR和SR小鼠。(D)在饮食前(t0)、HFD饲养的7天后(tl)和60天后(t2)，对照(n = 24) ,NR(η = 30)，和SR (η = 29)小鼠的体重监控。s (η =平均土标准误，非参数Mann和Whitney检验的ρ值*<0.05, **<0.001, ***〈0.0001.)
[0021]图2:饮食转换后7天和60天，C57BL/6HFD饲喂的或LFD饲喂的小鼠的1H NMR尿代谢谱。㈧来自LH)饲喂的小鼠或⑶ΗΠ)饲喂的小鼠的尿的平均1H NMR光谱。(C)7天时LFD和HFD饲喂的小鼠的尿代谢谱的OPLS-DA分数图。(D) 60天时LFD和HFD饲喂的小鼠的尿代谢谱的OPLS-DA分数图。(E)从OPLS-DA系数图获得的热点图显示发现在HFD和LFD饲喂的小鼠中显著不同的代谢物。通过颜色代码展示代谢物的相关值。(红色梯度:与HFD饲喂的小鼠正相关的代谢物和蓝色梯度:负相关的代谢物)。
[0022]图3:NR和SR小鼠的具体代谢标志。(A)来自NR小鼠或⑶SR小鼠的尿的1H NMR光谱平均值。(C) 7天时和(D) 60天时NR和SR小鼠的尿代谢谱的OPLS-DA分数图。(E)从OPLS-DA系数图获得的热点图显示发现在NR和SR小鼠中显著不同的代谢物。通过颜色代码展示代谢物的相关值。(红色梯度:与SR小鼠正相关的代谢物和蓝色梯度:负相关的代谢物)。
[0023]图4:BCAA、丁酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸代谢、Krebs循环和β氧化中涉及的代谢物的尿排泄型的作图。条状图显示代谢物的带有标准误的平均比率在第7天至第O天或第60天至第O天的积分。Y轴提示LF、HF、NR和SR小鼠的平均值(任意单位)。LF和HF或NR和SR的平均比率之间的显著差异使用非参数Mann Whitney检验计算:*〈0.05，**〈0.001, ***〈0.0001 (平均值，标准误和ρ值在补充表3和4中)。用虚线箭头突出间接代谢反应。
[0024]图5显示在预测NR和SR中代谢物重要性和稳健性，如通过随机森林分析所评估的。
[0025]表1:在高脂肪诱导的增重中代谢物和增重之间的关系的总结
[0026]表2:在抵抗增重(NR)和倾向增重(SR)个体中选择的代谢物随时间的变化倍数的总结
[0027]本发明部分地涉及生物标志物，其中生物标志物是己酰甘氨酸。
[0028]在本文描述的实验中，用HFD饲喂的小鼠展示出尿中己酰甘氨酸随时间增加。不希望被任何理论束缚，发明人目前认为己酰甘氨酸在体内获自肝中己酰-CoA与甘氨酸的结合并然后在尿中分泌。己酰-CoA是氧化的中间代谢物并且肉碱负责线粒体中脂肪酸的摄取，这是β氧化过程中的关键起始步骤。这些结果因此提示通过β氧化的脂肪酸分解的上调并且强调了线粒体中氧化性燃料的饱和，这可能改变能量内稳态。HFD小鼠的尿中若干Krebs循环中间物和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸途