测量中期因子或多效生长因子水平用于诊断生长的测定的制作方法
【专利说明】测量中期因子或多效生长因子水平用于诊断生长的测定
【背景技术】
[0001] 癌症是全世界主要的死亡原因。许多癌症的存活率可W通过早期发现和治疗得到 改善。然而，对于许多癌症，诊断方法是高度侵入性的，例如，设及外科活检。微创方法，如 针刺活检，往往不可靠。需要更可靠的癌症检测方法，同时也是微创检测方法。
[000引中期因子，也被称为MK，MDK和肥GF2,是富含碱性氨基酸和半脱氨酸的13-kDa肝 素结合生长因子，其影响各种祀细胞的生长、存活、迁移和基因表达。人中期因子是由MDK 基因编码。该MDK基因的表达是通过视黄酸或缺氧引起，并且通过糖皮质激素来抑制。MDK 的表达在妊娠中期中较高，但是在大多数成人组织中较低或不表达（Muramatsu等，Proc. Jpn.Acad. ,Ser.B, 86:410-425 (2010))。
[0003] MDK基因表达在维尔姆斯氏（Wilms)瘤标本中和在人胃、结肠、膜腺、肺和食管癌 细胞系中增加（Tsutsui等，CancerRes. ,53:1281-1285(1993))。中期因子的血清水平 在患者体内随着食道、胃、十二指肠、结肠、肝细胞、胆管/胆囊、膜腺、甲状腺或肺癌中升 高（Ikematsu等，Brit.J.Cancer, 83化）：701-706 (2000))。原位杂交和免疫组织化学分 析表明，MDK表达和中期因子的产生在人甲状腺乳头状癌标本中增加（Kato等，Mod.化th ol.， 13(10):1060-1065(2000))。
[0004] 需要用于检测生物样品中中期因子表达的经改良的方法、组合物和试剂盒，其可 能有助于对增殖性疾病（如癌症）的诊断和预后用途。
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[0006] 本发明提供了一种用于诊断对象中生长的方法，所述方法包括提供获取自对象的 生长样品，通过免疫测定来分析所述样品W确定中期因子的水平，并且将从所述样品确定 的中期因子的水平与对照比较。相对于所述对照，从所述样品确定的中期因子的水平是良 性生长或恶性生长的诊断依据。
[0007] 本发明也提供了一种用于诊断对象中生长的试剂盒，所述试剂盒包括抗体和指导 材料，所述抗体与人中期因子特异性结合，所述指导材料用于通过免疫测定来确定与对照 比较的、获取自对象的生长样品的中期因子水平。
【附图说明】
[000引图1是点状图，描绘了在细针穿刺（FNA)样品中的中期因子和甲状腺球蛋白的浓 度，所述样品是已经由组织学上证实的良性甲状腺结节（空屯、圆）或乳头状甲状腺癌（PTC) (实屯、圆）的样品。
[0009] 图2是柱状图，描绘了良性甲状腺结节或恶性乳头状甲状腺癌（PTC)的FNA样品 中的中期因子与甲状腺球蛋白的比例（MK/Tg，平均值+SEM)。仅通过细胞学发现是良性的 (良性-C)甲状腺结节与那些通过术后组织学发现是良性的（良性-H)甲状腺结节分别表 /J、-〇
[0010] 图3是点状图，描绘了来自同一个乳头状甲状腺癌的单个FNA样品中的MK/Tg比 例的变化。显示了从四个患有PTC的对象的每一个中获取的3-4单个穿刺的MK/Tg值。对 象5同时有术前的体内FNA样品（对象5-内）和甲状腺切除术之后立即获得的离体（ex vivo)FNA样品（对象5-离）。
[0011] 图4是线状图，描绘了用夹屯、酶联免疫吸附测定巧LISA)检测的已知浓度的重组 中期因子蛋白样品的吸光度，所述化ISA测定通过在含有或不含有10微克/毫升聚赖 氨酸（PLL)的检测抗体溶液中进行。
[0012] 图5是点状图，描绘了组织学证明为良性甲状腺结节（空屯、圆）或PTC组织（实 屯、圆）的离体FNA样品中的多效生长因子和甲状腺球蛋白的浓度。
[0013] 图6A是点状图，描绘了良性甲状腺结节（空屯、圆）或PTC组织（实屯、圆）的离体 FNA样品中的多效生长因子和甲状腺球蛋白（PTN/Tg)的比例。图6B是柱状图，描述了良性 甲状腺结节或PTC组织的离体FNA样品中的PTN/Tg的比例（平均值±SEM)，其中来自患有 Graves病的患者的良性结节与全部良性结节分开。
【发明内容】
[0014] 本发明提供了方法和试剂盒，所述方法和试剂盒用于根据生长样品中存在的中期 因子水平来确定生长是良性还是恶性。
[0015] 在一个方面，本发明提供了用于诊断对象中生长的方法。所述方法包括；(a)提供 获取自对象的生长样品，化）通过免疫测定来分析所述样品W确定中期因子的水平，并且 (C)将从所述样品中确定的中期因子的水平与对照比较。与所述对照比较，由所述样品中确 定的中期因子的水平是良性生长或恶性生长的诊断依据。
[0016] 在另一个方面，本发明提供了用于诊断对象中生长的试剂盒。所述试剂盒包括（a) 抗体，所述抗体与人中期因子特异性结合，W及（b)指导材料，所述指导材料用于通过免疫 测定来确定与对照比较的、获取自对象的生长样品中的中期因子水平。与所述对照比较，由 所述样品确定的所述中期因子水平是良性生长或恶性生长的诊断依据。
[0017] 如本申请中所用的术语"生长"是指组织的异常团块。"生长"可W是固体团块、流 体填充腔、或固体和流体组分的混合物。
[0018] 所有的肿瘤都是生长。肿瘤可W是实体瘤或血液肿瘤。实体瘤可W源自任何组织 或器官，包括但不限于肾、肝、子宫颈、皮肤、甲状腺、脑、乳腺、结肠、肺、膜腺、前列腺、胃、卵 巢、睾丸、膀脱、胆管、或胆囊。实体瘤也可W源自骨。血液肿瘤包括白血病和淋己瘤。
[0019] 在某些实施方式中，生长是结节。术语"结节"指的是在其他正常组织中存在的异 常团块。在一些实施方式中，结节是甲状腺结节。在其它实施方式中，结节是肺结节。
[0020] 在其他实施方式中，生长是包括固体、流体或半固体组分的"囊肿"或"脈肿"。
[0021] 在本发明的上下文中，所述样品可W是取自对象的器官或组织中存在的生长的任 何样品。所述样品可W取自所述生长的任何合适区域，例如接近生长中屯、的区域，或者靠近 生长外围的区域。
[0022] 对于本发明中使用的样品可W通过能够收集细胞的任何合适的方法来获取。所述 样品可W从外科或开放式活检获得，或者所述样品可W使用针刺活检获得。因此，所述样品 可来自"钻孔"、"刮"、刮除、细针穿刺（FNA)、巧针样品、哨位淋己结、或切除活检、或本领域 中已知的任何其它活检方法。
[0023] 在某些优选的实施方式中，所述样品由FNA获得。所述样品可W是全部由FNA获 得的材料，或所述样品可W是由FNA获得的材料的一部分。例如，样品可W是在针的内容物 在显微镜载玻片上呈现W用于常规细胞学或组织学分析之后，留在FNA针中的所述材料的 "洗脱物"或"漂洗物"。
[0024] 所述对象可W是人或任何合适的非人哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、羊、 牛、或灵长类动物。在一些实施方式中，对象是非人的实验动物模型。在一些实施方式中， 对象是灵长类动物。优选，对象是人。
[0025] 针对用于测定样品中中期因子水平的免疫测定，没有特别限定。在一些实施方式 中，免疫测定是酶联免疫吸附测定巧LISA)、夹屯、化ISA、放射免疫测定、免疫放射测定、凝 胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定，原位免疫测定蛋白质印迹、免疫沉淀测定、或免疫巧光测 定。在某些优选的实施方式中，所述免疫分析是"夹屯、化ISA",其中涂覆有中期因子特异性 的第一抗体的表面与含有样品的溶液在某种条件下接触，在所述条件中可在所述第一抗体 和存在于所述样品中的中期因子之间形成稳定的复合物，并且可W用本领域中任意合适的 方法使用中期因子特异性的第二抗体来检测所结合的中期因子，其中复合物的检测指示在 样品中存在中期因子。执行免疫测定的方法是本领域技术人员所熟知的（参见，例如，抗 体；实验室手册（Antibodies:AL油oratoryManual)，E.Harlow和D.Lane编辑，冷泉港实 验室（冷泉港，纽约，1988))
[0026]"特异性结合"中期因子或者中期因子"特异性"的抗体，指的是可识别至少一种中 期因子的抗原或表位并且可W在免疫测定中所用的标准的结合、洗漆、检测条件下保持稳 定结合的任何抗体、或其片段或衍生物。如本申请中所用的术语"抗中期因子抗体"和"针 对中期因子的抗体"指的是"特异性结合"中期因子或者中期因子"特异性"的抗体。
[0027] 中期因子特异性的抗体可W是结合中期因子的多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗 体、抗体单链或Fab片段。例如，针对中期因子的抗体可W是针对单一中期因子表位的单克 隆抗体，针对单个中期因子抗原组分的不同表位的单克隆抗体的组合，针对不同的中期因 子抗原组分的表位的单克隆抗体，针对相同的中期因子抗原的多克隆抗体，或针对不同的 中期因子抗原的多克隆抗体。
[002引中期因子特异性的抗体可W通过任何合适的方式来制备。
[0029] 多克隆抗体可W通过免疫宿主动物来制备，所述免疫例如通过用中期因子多肤或 其衍生物（例如片段或融合蛋白）注射来进行。合适的宿主动物包括但不限于兔、小鼠、大 鼠、绵羊、山羊等。中期因子多肤可W重组产生或通过化学合成，并且其片段或其它衍生物 或类似物，包括融合蛋白，可W用作免疫原W产生识别中期因子多肤的抗体。在一个实施方 式中，中期因子多肤或其片段可偶联至免疫原性载体，例如，牛血清白蛋白炬SA)或钥孔血 藍蛋白化LH)。佐剂可用于增强宿主动物的免疫应答，根据宿主的物种，包括但不限于弗氏 (化eund'S)(完全和不完全）、矿物凝胶（如氨氧化侣）、表面活性物质（如溶血卵磯脂）、 普朗巧克多元醇、聚阴离子、肤、油乳剂、钥孔血藍蛋白、二硝基酪和人佐剂（如BCG(卡介 苗）和短小椿状杆菌（Corynebacteriumparvum))。
[0030] 单克隆抗体可W通过任何在培养中用连续细胞系提供抗体的技术来制备。该 些技术包括，但不限于，最初由Kohler和Milstein(化1:脚日，256 ;495-497 (1975))开发 的杂交瘤技术、W及S体瘤（trioma)技术、人B-细胞杂交瘤技术（Kozbor等，Immunol. Today, 4:72 (1983);Cote等，Proc.化tl.Acad.Sci.USA, 80:2026-2030 (1983))，和邸V-杂 交瘤技术（Cole等，"EBV杂交瘤技术及其对人肺癌的应用（TheEBV-hybridomatechnique anditsappli