（Sigma-Al化ich公司，圣路 易斯，密苏里州）的水溶液加入到试剂盒提供的生物素标记的抗体溶液中，然后100yL的 该种溶液加入到各孔中。将板在室温下解育1小时，在W300RPM的轨道式微孔板摇床上振 摇。然后用在试剂盒中提供的洗漆缓冲液W每个孔0.35mL来洗漆5次。轻敲后，将随试剂 盒提供的100yL链霉亲和素-HRP偶联溶液添加到每个孔中。将板在室温下解育30分钟， 在W300RPM的轨道式微孔板摇床上振摇。用洗漆液洗漆5次并轻敲后，将随试剂盒提供的 底物溶液加入到每个孔中。将板用侣巧覆盖，并在室温下解育7分钟。通过每孔加入100yL 随试剂盒提供的终止溶液来终止显色。用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度。批内变异 系数（CV)对高浓度为3.4%，对低浓度为5.2%。检测限度为8. 7pg/mL中期因子。通过与 对照比较来计算样品中的中期因子的绝对浓度，所述对照由已知浓度的重组人中期因子稀 释数倍组成。
[0073] 对每个洗脱的等分试样也进行甲状腺球蛋白（Tg)测定。简单地说，每个洗脱的等 分试样在生理盐水中稀释10倍，甲状腺球蛋白浓度根据制造商的说明用化学发光免疫分 析测定（Immulite2000XPi，英国西口子公司）来检巧U。甲状腺球蛋白试剂（美国西口子医 疗诊断公司）用于在需要时进一步稀释各个样品。
[0074] 对每个对象，对多次针刺的中期因子浓度或中期因子与甲状腺球蛋白的比例（MK/ Tg)取平均。使用SigmaPlot软件（版本12)进行统计分析。通过回归来分析中期因子和甲 状腺球蛋白浓度之间的关系。通过T-检验比较良性与恶性结节中的中期因子和MK/Tg。对 于该种分析，对所有FNA样品（单独的针刺）进行平均，W对每个对象获得单一的平均值。 对同时有体内和离体样品的对象，只包括体内的值，体内的值在临床上更相关。P值<0.05 被认为是显著的。
[0075] 对于正常甲状腺组织样品（离体获取自远离任意结节的甲状腺），所述FNA针的 洗脱物含有很低浓度的MK化03 + 0.Olng/血）。MK浓度在离体获取自由外科病理学确定 良性的结节的样品中化07 + 0. 02ng/mL)和在体内获取自细胞学上良性的结节的样品中 (0. 02 + 0.Olng/mL)也很低。在患有通过外科证实的良性结节的对象中，MK浓度在腺瘤样 / 胶体结节（0. 027 + 0. 016ng/mL，n= 12)，滤泡状腺瘤（0. 079 + 0. 07：3ng/mL，n= 3)，W及 患有潜在慢性淋己细胞性甲状腺炎的良性结节（0. 008 + 0. 00化g/mL，n= 5)中同样也较 低。来自患有Graves病的对象的MK浓度也较低（0. 062 + 0. 013ng/mL，n= 3)。与此相反， 在来自乳头状甲状腺癌（PTC)的样品中MK浓度显示出比良性结节化72 + 0. 27ng/血对比 0. 03 + 0.Olp= 0. 006)更高的水平，而不管样品是在体内还是离体获得的（图1)。相反 地，在PTC的样品中的甲状腺球蛋白浓度比在良性结节样品中的低（7540±4600ng/血对比 110000±28900ng/mL，p<0. 001)(图 1)。
[0076] 本实施例的结果表明，FNA洗脱样品中的中期因子蛋白水平在乳头状甲状腺癌中 比在正常甲状腺组织或良性甲状腺结节中的高。
[0077] 实施例2
[007引本实施例说明了用于诊断甲状腺结节方法，所述诊断是通过确定甲状腺结节的样 品中中期因子与甲状腺球蛋白的比例来进行。
[0079] 根据实施例1中所描述的测定结果来计算中期因子与甲状腺球蛋白的（MK/Tg)比 例。MK浓度与来自良性结节和恶性结节的FNA洗脱样品中甲状腺球蛋白的浓度成正相关 (分别为R2 = 0. 09,p<0. 001和R2 = 0. 53,p<0. 001)。因为在洗脱流体中的MK和甲状腺球 蛋白浓度都依赖于样品中存在的甲状腺组织的量，所W可能存在该种相关性。因此，为校正 甲状腺组织的量，通过计算MK/Tg的比例来将中期因子水平标准化为甲状腺球蛋白水平。 同时有体内和离体样品的患者中，MK/Tg的比例在两种类型的样品中是相似的（分别针对 良性结节是 1. 81 + 0. 95ng/mg对比 1. 74 + 0. 70ng/mg，P=N巧。
[0080] 来自正常甲状腺组织和Graves病的样品显示较低的中期因子与甲状腺球蛋白 的比例。同样地，良性结节也显示低的值，所述良性结节包括腺瘤样/胶体结节、滤泡性 腺瘤和在受慢性淋己细胞性甲状腺炎影响的甲状腺中的良性结节。与此相反，MK/Tg的比 例在乳头状甲状腺癌（PTC)的样品中比良性结节中高得多（对于具有组织学诊断的对象 403±285ng/mg对比 1. 51 + 0. 55ng/mg，P<0. 001)(图 2)。MK/Tg的比例随着PTC中结节尺 寸有增加的趋势，但该种关系没有达到统计学显著性（R2= 0. 51，P= 0. 09)。
[0081] 对于前面的分析中，所有FNA样品（独立针刺）对每个对象取平均值。为了评估 MK/Tg比例的抽样变化性，对来自同一恶性病变的单个FNA样品进行了比较。单个样品的数 据之间合理地吻合，并且所有的单个样品的MK/Tg比例比确定自良性病变的MK/Tg比例高 很多（图3)。
[0082] 本实施例的结果表明，在FNA洗脱样品中的中期因子与甲状腺球蛋白的比例在乳 头状甲状腺癌中比在正常甲状腺组织或良性甲状腺结节中高。
[0083] 实施例3
[0084] 本实施例说明增加免疫测定的灵敏度的方法，所述免疫测定用于确定样品中中期 因子的水平。
[0085] 如实施例1中所述，使用市售试剂盒（捷克共和国BioVendor公司）进行中期因 子夹屯、化ISA免疫测定，不同的是在200yL的TBSTA中而不是甲状腺洗脱物中制备浓度为 0、0. 033、0. 1、0. 3、0. 9ng/mL的重组人中期因子。增加重组人中期因子浓度会增强在夹屯、 ELISA中的信号（图4)。将10yg/血聚-k赖氨酸（PLL)加入到检测抗体溶液会显著增 强每个中期因子浓度的总吸光度值W及响应曲线的斜率（图4)。
[0086] 本实施例的结果表明，将聚赖氨酸加入到包含中期因子特异性抗体的溶液中 增加了免疫测定的灵敏度。
[0087] 实施例4
[008引本实施例说明了用于诊断甲状腺结节的方法，所述诊断是通过免疫测定确定甲状 腺结节的样品中多效生长因子的水平来进行。
[0089] 从患有甲状腺结节的成年对象获得甲状腺组织样品，所述对象经受了甲状腺切除 术（n= 31)。切除甲状腺后，由外科医生和病理学家对感兴趣的结节进行鉴定，并且将所选 择的带有周围组织的结节进行二等分W获得样品。通过组织学分析鉴定来自23个对象的 25个良性结节和来自8个对象的10个患有PTC的结节。通过组织学分析鉴定无滤泡状甲 状腺癌、甲状腺髓样癌或甲状腺未分化癌。2个对象患有潜在的Graves病。1个具有良性 结节的对象患有潜在的慢性淋己细胞性甲状腺炎。
[0090] 通过重复地将25号针进入结节W模仿经皮FNA来进行离体细针穿刺（FNA)。用 500UL含1%牛血清白蛋白炬SA)的磯酸缓冲盐水（PB巧漂洗针W得到洗脱样品，将所述 洗脱样品进行等分并储存在-80°C，直至免疫测定。每个结节获得多个离体FNA样品（平 均3. 0次）。通过在临近良性结节或恶性结节的正常甲状腺组织上进行离体FNA，从11个 对象获得正常甲状腺组织样品。
[0091] 使用小鼠抗多效生长因子的单克隆抗体（3B10,购自马萨诸塞州比勒利卡的EMD 密理博公司）和生物素化的抗人多效生长因子山羊IgG(购自明巧苏达州明巧阿波利斯的 R&D系统公司）进行多效生长因子夹屯、化ISA免疫测定。3B10抗体在PBS中稀释至0. 5yg/ 血，在96孔板中W100化/孔，4°C下解育过夜。用每孔250yLPBST(PBS, 0. 05 %吐温?20) 将孔洗漆3次。每孔用250yLPBS在4°C下终止所述孔2小时，所述PBS含有3%BSA和 0.2%吐温?2〇。不经洗漆，将板倒置，并对着纸巾用力敲击来使板干燥。将lOOuL的甲状 腺洗脱样品在200yLPBSTA(PBS，1%BSA，0. 5%吐温?2〇)中稀释。将100yL稀释样品一 式两份转移至板中。将所述板在室温下温和揽拌解育2小时，然后用每孔250uLPBST洗 漆3次。轻敲倒置的板W除去残余的液体后，将生物素化的抗人多效生长因子山羊IgGW 500ng/mL的浓度加入，并稀释在含5. 7mEq/L氯化巧和0. 5 %BSA抑为6的0. 9 %的生理盐 水中。将所述板在室温下温和揽拌解育1小时。用每孔250ULPBST将孔洗漆5次。轻敲 倒置的板W除去残余的液体后，将100yL链霉亲和HRP偶联物溶液（伊利诺伊州罗克福德 的赛默科技公司（ThermoScientific))WPBS中25ng/mL的浓度加入至每个孔中，将板在 室温下温和揽拌解育30分钟。用PBST洗漆5次后，将100yL的3, 3'，5, 5' -四甲基联苯 胺（TMB)加入到每个孔中。将板用侣巧覆盖，并在室温下解育7分钟。加入100UL终止液 终止显色。用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度。批内变异系数对高浓度为5. 1%，对低 浓度为7.3%。批间变异系数为6.4%。通过与对照比较，计算样品中的多效生长因子的绝 对浓度，所述对照由已知浓度的重组人多效生长因子稀释数倍组成。
[0092] 对每个洗脱的等分试样也进行甲状腺球蛋白（Tg)测定。简单地说，50UL甲状腺 洗脱样品在生理盐水中稀释10倍，甲状腺球蛋白浓度根据制造商的说明用化学发光免疫 分析测定（Immulite2000XPi，英国西口子公司）来检测。甲状腺球蛋白试剂（美国西口子 医疗诊断公司）用于在需要时进一步稀释各个样品。
[0093] 对每个结节，对多针刺的多效生长因子（PTN)浓度或者多效生长因子与甲状腺球 蛋白的比值（PTN/Tg)取平均W获得单一的平均值。使用SigmaPlot软件（版本12)进行 统计分析。在将多效生长因子浓度和甲状腺球蛋白浓度该两个变量作对数变换后，通过 化arson相关来分析两者之间的关系。通过T-检验比较良性结节对恶性结节中的多效生长 因子和PTN/Tg。P值<0.05被认为是显著的。
[0094] PTN在正常甲状腺组织的平均浓度为29±13pg/mL。来自PTC组织的样品中的PTN 浓度比来自良性结节的样品中的高（85±25pg/mL对比35±llpg/m