生物检材中钩吻素甲和钩吻素子的液相色谱-串联质谱检测方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于生物样品检验领域，具体涉及一种生物检材中钩吻素甲和钩吻素子的 液相色谱-串联质谱检测方法。
【背景技术】
[0002] 钩吻，又名大茶药、断肠草等，是马钱科胡蔓藤属的全草，产于浙江、福建、广 东、广西、贵州、云南等地。钩吻全株有毒，根、茎、叶均含有生物碱，以根部含量最高，根皮 最高，该类植物因其是毒性极强，多用于外用，应用不当或误服可致中毒，有时还可致命。 国内钩吻主要毒性成分是钩吻碱，有从钩吻中可以分离出钩吻素子（Koumine)、钩吻素甲 (Geliemine)、钩吻素寅（Kouminicine)、钩吻素卯（Kouminidine)、钩吻素辰（Kounidine)、 钩吻素丙（Sempervirine)、钩吻素丁（Koumicine)和钩吻素戊（Koumidine)等生物碱。因 产地不同所含的生物碱的种类和含量也略有差异，广东产的钩吻根中曾分离得到钩吻素 子、卯、丁和戊；而福建产的分离到了钩吻素甲、丁、子、卯、戊、己等生物碱。其中钩吻素子含 量最高。国外钩吻所含化学成分与国内的钩吻存在差异。如北美产钩吻除与国内钩吻某些 相同的化学成分外含量相差很大，以钩吻素甲为主要成分含量最高。钩吻中毒主要抑制延 髓呼吸中枢，并抑制脑和脊髓的运动中枢。临床表现以呼吸系统、神经系统症状为主，可出 现呼吸衰竭和呼吸肌麻痹，是钩吻中毒最常见的死因。
[0003] 钩吻素子（左）和钩吻素甲（右）结构式如下：
[0004]
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种生物样品中钩吻素甲和钩吻素子的液相色谱-串联质谱（LC-MS/ MS)检验方法，适用于生物样品（血、尿、肝、肾等）中钩吻素甲和钩吻素子的定性定量检验， 也适用于体外样品和可疑物证的检验。
[0006] 本发明的原理是以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物样品 进行提取、净化及浓缩后，用液相色谱-串联质谱仪进行检测，以保留时间（Rt)、质谱特征 离子碎片峰和相对丰度作为定性判断依据；与平行操作的添加标准品响应值比较，根据峰 面积之比，用外标法进行定量分析。
[0007] 具体的，本发明一方面的目的在于提供一种生物检材中钩吻素甲和钩吻素子的液 相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0008] a)样品前处理：取生物液体样品1. OmL~2. OmL或生物组织样品1. 0g~2. 0g剪 碎于具塞试管中；上述样品加一定量的氢氧化钠溶液调p!19~10,加入5. OmL~10.0 mL乙 酸乙酯，振荡l〇min，高速离心10min ;分离有机相后，加有机溶剂进行第二次提取，合并两 次有机相，置于50°C浓缩仪上挥干；残渣用500 y L~1000 y L初始流动相定容，过0. 22 y m 微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析；
[0009] b)样品分析：
[0010] 色谱柱：kinetex C18 ;进样量：lyL~10yL;流动相：A为含0. 1%甲酸的10mM 甲酸铵【本发明0. 1%甲酸的10mM甲酸铵是指：浓度为l〇mmol/L的甲酸铵水溶液中甲酸的 体积分数为〇. 1 %，以下不再赘述】，B为甲醇；梯度洗脱【本发明中的A、B均为体积分数，以 下不再赘述】：〇? 2min，A 为 95%，B 为 5% ;3. Omin，A 为 5%，B 为 95% ;5. Omin，A 为 5%，B 为 95% ;5. lmin，A 为 95%，B 为 5% ;7.0min，A 为 95%，B 为 5% ;流速为 0.5mL/min;
[0011] 离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描（ESI+);检测方式：多反应监测 (MRM);电喷雾电压：5500V ;离子源温度：650°C ;雾化气压力：55psi ;气帘气压力：50psi ; 辅助气压力：50psi。
[0012] 在本发明的另一个实施方案中，尤其是对于新鲜血液样品，其中a)样品前处理还 能够替换为：取生物液体样品1. OmL~2. OmL或生物组织样品1. 0g~2. 0g剪碎于具塞试 管中；加入pH 5. 8磷酸盐缓冲液3mL~5mL，充分混旋，超声15min，8000r/min以上高速 离心20min，取上清液待过柱；取3CC HLB固相小柱依次以3mL甲醇、3mL水活化，将离心后 的上清液分别过柱，流速为〇. 5mL/min~1. OmL/min ;再以3mL去离子水和3ml0. 5%甲醇 水溶液【本发明中〇. 5%甲醇水溶液是指：甲醇水溶液中甲醇的体积分数为0. 5%，以下不 再赘述】先后淋洗小柱；用2mL甲醇洗脱，收集洗脱液置于50°C快速浓缩仪上吹干，残渣用 500 y L~1000 y L初始流动相定容，过0. 22 y m微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质 谱仪分析。
[0013] 在本发明的一个具体的实施方式中，其中a)样品前处理步骤中，还包括另取3份 相同基质的空白样品，1份作为空白样品，另2份添加钩吻素甲和钩吻素子标准100ng制备 成添加样品；或者还包括另取相同基质的空白样品两份，分别添加相应目标物标准品（添 加量应与样品粗测量相近）制备成添加样品，混匀。
[0014] 在本发明的一个具体的实施方式中，液体样品为血液、尿液、唾液；所述组织样品 为肝脏、肾脏。
[0015] 在本发明的一个具体的实施方式中，C18柱为3. 0mmX 50mm，2. 6 y m柱或等效色谱 柱。
[0016] 在本发明的一个优选的实施方式中，取液体样品1.0mL-2.OmL;或者组织样品 1. 0g-2. 0g〇
[0017] 在本发明的一个优选的实施方式中，乙酸乙酯的加入量为5. 0mL-10.OmL。
[0018] 在本发明的一个优选的实施方式中，残渣用500yL-1000yL初始流动相定容。
[0019] 在本发明的一个优选的实施方式中，磷酸盐缓冲液的加入量为3mL-5mL。
[0020] 本发明另一方面的目的在于提供生物样品中钩吻素甲和钩吻素子的液相色 谱-串联质谱（LC-MS/MS)检验方法的应用，应用于法庭科学领域，尤其是应用于生物样品 中钩吻素甲和钩吻素子的定性定量检验，以及适用于体外样品和可疑物证的检验。
[0021] 优选地，所述生物样品为血、尿、肝、肾。
[0022] 本发明的有益效果在于：本发明样品处理采用液液萃取或者固相萃取，操作简单， 样品用量少；采用LC-MS/MS灵敏度高，能有效的排除假阳性，定性、定量准确度高。
【附图说明】
[0023] 图1表示钩吻素甲和钩吻素子液相色谱_质谱提取离子流图；
[0024] 图2表示钩吻素甲液相色谱-质谱提取离子流图；
[0025] 图3表示钩吻素子液相色谱-质谱提取离子流图。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1定性分析
[0027] 1、试剂
[0028] 本发明试验用水为一级水（见GB/T 6682-2008规定）：
[0029] a)磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠为分析纯；
[0030] b)甲醇、乙腈、甲酸铵、甲酸、乙酸乙酯均为色谱纯；
[0031]C)磷酸盐缓冲液（pH 5. 8):取磷酸二氢钾8. 34g与磷酸氢二钾0. 87g，，分别置于 1000mL容量瓶中，加一级水溶解、稀释至刻度；
[0032] d)含0. 1%甲酸的10mM醋酸铵：称取0. 384g的醋酸铵，加入一定量的一级水溶 解，并加入〇. 5mL甲酸混匀，将混合液用一级水稀释至500mL ;
[0033] e)标准溶液：
[0034] 1)钩吻素甲和钩吻素子标准储备液：精确称取钩吻素甲和钩吻素子标准品各 50mg，分别于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，配制成1. Omg/mL钩吻素甲和 钩吻素子标准储备液，冷藏保存6个月；
[0035] 2)钩吻素甲和钩吻素子标准工作液：精确量取1. 0mg/mL钩吻素甲和钩吻素子标 准储备液各10mL，分别于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成0. 10mg/mL的钩吻素 甲和钩吻素子标准工作液，冷藏保存1个月。试验中所用其它浓度的标准溶液均从上述储 备溶液用甲醇稀释而得，冷藏保存为1个月。
[0036] 2、仪器和材料
[0037] a)液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI)和三重四极杆质量分析器；
[0038] b)电子天平：感量0?lmg和0? 01g;
[0039] c)高速离心机；
[0040] d)振荡器；
[0041] e)浓缩仪；
[0042] f)移液器：量程 10yL~100yL，100yL~1000yL，1000yL~5000yL;
[0043] g) pH试纸：范围1~14 ;
[0044] h)固相萃取小柱：HLB固相萃取柱或等效固相小柱；
[0045] i)微孔有机滤膜：0? 22ym。
[0046] 3、样品