L、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为86. 1%、 90. 4%、97. 0% ;RSD%分别为 3. 3、3. 5、2. 0。
[0145] 钩吻素子添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为85. 6%、 89. 8%、94. 9% ;RSD%分别为 3. 7、3. 2、1. 3。
[0146] 钩吻素甲和钩吻素子在10~1000ng/mL浓度范围内均有着良好的线性关系。
[0147] 钩吻素甲添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD% (日内）分别为 1. 43、2. 96、2. 57, RSD% (日间）分别为 3. 31、2. 67、4. 01。
[0148] 钩吻素子添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD% (日内）分别为 1. 53、2. 70、2. 19, RSD% (日间）分别为 3. 40、2. 65、4. 00。
[0149] 以信噪比10/1计，该方法的最小定量限为0. 2ng/mL，以信噪比3/1计，该方法的最 小检出限为0. 08ng/mL。
[0150] 实施例4利用新鲜血液对本发明的方法进行评价
[0151] 1、试剂，同实施例1。
[0152] 2、仪器和材料，同实施例2。
[0153] 3、样品萃取
[0154] 分别取空白的新鲜血液1.OmL于具塞试管中；分别添加钩吻素甲和钩吻素子标准 品制备成添加样品，混勾。
[0155] 分别加入pH 5. 8磷酸盐缓冲液5mL，充分混旋，超声15min，8000r/min以上高速离 心20min，取上清液待过柱。取3CC HLB固相小柱依次以3mL甲醇、3mL水活化，将离心后的 上清液分别过柱，流速为1.OmL/min;再以3mL去离子水和3ml0. 5%甲醇水溶液先后淋洗小 柱；用2mL甲醇洗脱，收集洗脱液置于50°C快速浓缩仪上吹干，残渣用1000 yL初始流动相 定容，过0. 22 y m微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。
[0156] 4、仪器检测
[0157] 4. 1液相色谱-串联质谱仪条件
[0158] 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：
[0159] 色谱柱：kinetexC18 (3. OmmX 50mm，2. 6 y m 柱或等效色谱柱；
[0160] 流动相及梯度洗脱条件见表1 ;
[0161] 表1流动相和梯度洗脱条件
[0162]
[0163]进样量：lyL ~10yL;
[0164] 扫描方式：正离子扫描（ESI+);
[0165] 检测方式：多反应监测（MRM);
[0166] 电喷雾电压：5500V;
[0167] 离子源温度：650°C;
[0168] 雾化气压力：55psi ;
[0169] 气帘气压力：50psi ;
[0170] 辅助气压力：50psi ;
[0171] 监测离子对、去簇电压、碰撞能参见表2。
[0172] 表2监测离子对、锥孔电压、碰撞能
[0173]
[0174] 钩吻素甲添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为88. 3%、 93. 1%、98. 9% ;RSD%分别为 3. 0、3. 3、1. 0。
[0175] 钩吻素子添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为87. 5%、 92. 8%、99. 0% ;RSD%分别为 3. 2、3. 0、1. 0。
[0176] 钩吻素甲和钩吻素子在10~1000ng/mL浓度范围内均有着良好的线性关系。
[0177] 钩吻素甲添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD% (日内）分别为 1. 30、2. 53、2. 12, RSD% (日间）分别为 3. 25、2. 43、4. 00。
[0178] 钩吻素子添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD% (日内）分别为 1. 28、2. 63、2. 11，RSD% (日间）分别为 3. 30、2. 52、4. 01。
[0179] 以信噪比10/1计，该方法的最小定量限为0. 2ng/mL，以信噪比3/1计，该方法的最 小检出限为0. 08ng/mL。
[0180] 实施例3和实施例4中，回收率的计算、线性关系的得出、以及日内和日间精密度， 均采用现有技术中的常规方法：以测得的添加各生物样品中钩吻素甲或钩吻素子的峰面积 与相同浓度钩吻素甲或钩吻素子标准工作溶液峰面积的比值来计算回收率。用测得的钩吻 素甲或钩吻素子的峰面积（Y)对生物样品待萃取标准液中钩吻素甲或钩吻素子浓度（X)求 得线性回归，得到回归方程，进而得到线性关系。计算钩吻素甲或钩吻素子峰面积的相对标 准偏差，得到日内精密度；连续测三天，计算钩吻素甲或钩吻素子峰面积三天的相对标准偏 差，得到日间精密度。
【主权项】
1. 生物检材中钩吻素甲和钩吻素子的液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于，包 括如下步骤： a) 样品前处理：取生物液体样品或生物组织样品剪碎于具塞试管中；上述样品加一定 量的氢氧化钠溶液调p!19~10,加入乙酸乙酯，振荡lOmin，高速离心10min ;分离有机相 后，加有机溶剂进行第二次提取，合并两次有机相，置于50°C浓缩仪上挥干；残渣用初始流 动相定容，过〇. 22 y m微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析； b) 样品分析： 色谱柱：kinetex C18 ;进样量：1 y L~10 y L ;流动相：A为含0? 1 %甲酸的IOmM甲酸 铵，B 为甲醇；梯度洗脱：0? 2min，A 为 95%，B 为 5% ;3. Omin，A 为 5%，B 为 95% ;5. Omin，A 为5%，8为95%;5.11^11^为95%，8为5%;7.〇111111^为95%，8为5% ;流速为0.511117 min ； 离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描（ESI+);检测方式：多反应监测（MRM); 电喷雾电压：5500V ;离子源温度：650°C ;雾化气压力：55psi ;气帘气压力：50psi ;辅助气 压力：50psi。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其中a)样品前处理还能够替换为：取生物液体样 品或生物组织样品剪碎于具塞试管中；加入pH 5. 8磷酸盐缓冲液，充分混旋，超声15min， 8000r/min以上高速离心20min，取上清液待过柱；取3CC HLB固相小柱依次以3mL甲醇、 3mL水活化，将离心后的上清液分别过柱，流速为0. 5mL/min~1.0 mL/min ;再以3mL去离子 水和3ml0. 5%甲醇水溶液先后淋洗小柱；用2mL甲醇洗脱，收集洗脱液置于50°C快速浓缩 仪上吹干，残渣用初始流动相定容，过0. 22 y m微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱 仪分析。3. 根据权利要求1-2所述的检测方法，其中液体样品为血液、尿液、唾液；所述组织样 品为肝脏、肾脏。4. 根据权利要求1-2所述的检测方法，其中C18柱为3. OmmX 50mm，2. 6 y m柱或等效色 谱柱。5. 根据权利要求1-2所述的检测方法，其中取生物液体样品1.0 mL-2. OmL ;或者生物组 织样品 1.0 g-2. Og。6. 根据权利要求1-2所述的检测方法，其中乙酸乙酯的加入量为5. OmL-IO. OmL。7. 根据权利要求1-2所述的检测方法，其中残渣用500 y L-1000 y L初始流动相定容。8. 根据权利要求2所述的检测方法，其中磷酸盐缓冲液的加入量为3mL-5mL。9. 权利要求1-2所述的检测方法的应用，其特征在于，应用于生物样品中钩吻素甲和 钩吻素子的定性定量检验，以及适用于体外样品和可疑物证的检验。10. 根据权利要求6所述的应用，其中生物样品为血、尿、肝、肾。
【专利摘要】本发明涉及生物检材中钩吻素甲和钩吻素子的液相色谱-串联质谱检测方法，包括如下步骤：取生物液体样品或生物组织样品剪碎于具塞试管中；上述样品加一定量的氢氧化钠溶液调pH9～10，加入乙酸乙酯，振荡10min，高速离心10min；分离有机相后，加有机溶剂进行第二次提取，合并两次有机相，置于50℃浓缩仪上挥干；残渣用初始流动相定容,过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。本发明的检测方法简单高效、快速灵敏、准确度高，具有广泛的实用性，能够应用于生物样品中钩吻素甲和钩吻素子的定性定量检验，以及适用于体外样品和可疑物证的检验。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/88
【公开号】CN104991019
【申请号】CN201510370312
【发明人】王芳琳, 栾玉静, 姚伊人, 应剑波, 刘耀
【申请人】公安部物证鉴定中心
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月29日