专利名称：增强子Hr3在促进hycu-ep32蛋白增量表达中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因领域，特别涉及家蚕的转基因技术。
背景技术：
转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰。转基因技术是现代生物学研究中的一项重要的技术，在功能基因研究、生物素材创新、现代遗传育种等方面发挥着重要的作用。家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目昆虫，蚕丝业每年为蚕农创收100多亿元，蚕丝业为世界经济、文化、社会发展作出了重要贡献。但是，当家蚕遭遇病毒侵害，通常会造成蚕业的巨大损失。据统计，我国养蚕业最为发达的几个主产区，每年因病毒性疾病所造成的损失，约占总蚕病损失的70-80%。其中家蚕核型多角体病毒病又是三大病毒病中最常见、 危害最严重的一类蚕病，该病传染性极强，难以控制。引起核型多角体病毒病的病原为家蚕核型多角体病毒iBombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus, BmNPV)，BmNPV属于杆状病毒科，真杆状病毒亚科，核型多角体病毒属，病毒粒子呈杆状，全基因组大小为128413bp ；病毒结构主要由外层的囊膜和内层的核衣壳组成，在不同感染时期分别以出芽型病毒粒子(budded virus, BV)和包埋型病毒粒子 (occluded virus, 0V)两种形态存在，而多角体是在感染细胞的核或质中产生的包含和保护病毒粒子的一种蛋白质结晶，很稳定。多角体病毒对不良环境、消毒药剂等有较强的抵抗性，在环境中可以长期存活，但极易溶于碱性溶液；当家蚕食下多角体病毒，在中肠强碱性消化液(PH9.2 9. 4)作用下多角体被溶解，释放的病毒粒子OV借囊膜与中肠上皮细胞微绒毛膜的融合作用脱去囊膜，核衣壳进入中肠细胞开始原发感染(Primary infection), 在细胞内复制核衣壳并通过“出芽”方式产生BV进入血体腔，继而感染其他组织细胞。最终，蚕体多以体壁破裂，流出病毒多角体浓汁而死。病毒多角体浓汁中含有大量的病毒粒子，污染蚕座环境，使得周围健康蚕感染病毒。可见，家蚕核型多角体病毒病是蚕业生产中的一个重要的危害原，一旦产生，极易爆发。由于家蚕核型多角体病毒病在蚕业生产中危害重大，蚕业界一直希望能够培育出对此病毒具有较高抗性的蚕品种。但是，由于目前病毒致病分子机制研究较少，加之抗性品种培育手段多采用传统的遗传筛选的办法，周期长而且定向性差，所以收效甚微。转基因技术在生物素材创新、现代遗传育种等方面发挥着重要的作用，自2000年日本科学家报道首次成功培育转基因家蚕以来，国内外已陆续报道转基因家蚕成功的消息。目前已经有报道外国学者尝试通过转基因干涉病毒基因的方法来提高家蚕的抗性，他们利用的是家蚕多化性品系的非滞育卵，主要是因为多化性家蚕品种所产的卵为生种卵， 其不需要任何的人工处理便能够在适当的温湿度下连续发育直至孵化，这个特点极大地方便了转基因实验中的操作控制。但是，通过转基因干涉利用多化性家蚕品种制备的抗病毒品系具有以下两个方面明显的缺陷①生产用种普遍为二化性滞育种，用多化性家蚕品种制备的抗病毒品系不利于生产推广，同时与滞育性的家蚕品种相比较，多化性家蚕品种不具有滞育期，对其继代维持只能依靠连续的饲养繁殖，这样需要耗费大量的人力物力对获得的转基因家蚕品系进行维持和继代，同时也大大增加了获得的转基因家蚕品种资源丢失的风险。②转基因干涉品系只能在mRNA水平发挥作用，不能在病毒DNA复制和蛋白合成水平发挥作用。因此，利用家蚕滞育品种，制备一种能在病毒DNA复制和蛋白合成水平抑制病毒增殖的转基因品系是一个有效可取的方法。先前的研究结果显示，当家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和美国白蛾核型多角体病毒(HycuNPV)共转染BmN-4细胞，BmNPV在BmN_4细胞中的增殖将受到抑制，HycuNPV编码的如《/_印32基因与BmNPV的增殖被抑制有关。家蚕自身抗性的有限导致宿主对抗性蛋白的大量需求。然而，遗憾的是，家蚕自身体内并不存在Hycu-EP32蛋白。BmNPV的同源重复区(homologous regions, hr3)具有复制起始位点的功能，可以对启动子行使增强子功能。 在细胞水平，Hr3增强子能使启动子的活性增强几倍，而Hr3+BmNPV的IEl蛋白能使启动子的活性增强上千倍。BmNPV的39kP启动子具有明显的BmNPV诱导启动活性，能使家蚕在受到BmNPV侵染的时候启动下游基因的表达。在棉花、玉米和水稻等物种中已经有利用转基因增量表达抗性基因来培育抗性品种的相关报道。到目前为止，利用滞育性家蚕品种增量表达外源抗病毒蛋白的方法和转基因品系在国内外还未见报道。因此，探索利用家蚕滞育品种，转基因增量表达外源抗病毒基因，抑制病毒在家蚕细胞中的增殖来提高家蚕的抗性是培育抗性品种的必然选择，也是加速科技成果实用化的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供增强子Hr3的新应用，该应用为提高家蚕核型多角体病毒抗性提供了新的思路。本发明的目的之二在于提供一种增量表达载体，其能显著提高 hycu-ep-il蛋白的表达量；本发明的目的之三在于提供所述增量表达载体的制备方法，该方法操作简单，适用于大规模运用，其稳定性佳；本发明的目的之四在于提供所述增量表达载体的应用，该应用降低了家蚕感染核型多角体病毒的风险。本发明增强子Hr3在促进hycu-印32蛋白增量表达中的应用，利用转基因增量表达外源抗病毒蛋白来制备抗BmNPV家蚕品种的方法，依次通过以下步骤实现
(1)利用转座载体pBac[3XP3-EGFPafm]构建包含病毒39kP启动子、如《/_印32基因全长序列和终止信号序列SV40片段的增量表达载体pBac[39kP-A_F /-e/732-SV40-3XP3 -EGFP afm] (pb-EKG)以及包含增强子Hr3、39kP启动子、如《/-印32基因全长序列和终止信号序列 SV40 片段的增量表达载体 pBac[Hr3-39kP- Aycu-ep32-SYA0~3 X P3-EGFP afm] (pb-HEKG)；
(2)将家蚕932品种通过15°C低温催青解除滞育，将产下的非滞育蚕卵收集好，在蚕卵产后池-处用显微注射仪内将3-如1、总浓度为400ng/ul的混合质粒(增量表达载体和辅助质粒按1:1混合)注射进蚕卵蚕卵，然后用无毒胶水将注射孔封住。(3)将完成注射的蚕卵在35%的甲醛蒸汽中消毒^iin后，置于25°C、相对湿度为 80%的环境中进行催青直到孵化，将孵化的蚁蚕置于标准条件中饲养，将当代(GO)的蚕蛾进行自交或者回交，将滞育性的Gl代蚕卵即时浸酸解除滞育，胚胎发育第六天在荧光显微镜下面筛选转基因阳性个体，将获得的转基因个体单蛾区正常饲养，继代扩大群体数量。(4)通过RT-PCR检测转基因系统中hycu-印 >2的表达量，确定hycu-印 >2确实在所获得的转基因系统中表达。(5)将转基因系统EKG、HEKG和正常932在3龄起蚕，用半致死剂量的BmNPV病毒通过经口感染，设置不添食的转基因和正常932对照，连续10天统计死亡率。结果显示转基因系统HEKG对BmNPV病毒的抗性明显提高。(6)通过荧光定量PCR检测hycu-印 ^在攻毒后的表达量变化情况，确定在HEKG 系统中，如《/-印32的表达量在攻毒后大大增加。(7)在攻毒后Mh，EKG、HEKG和正常932各取10头蚕提取总DNA，通过荧光定量 PCR检测BmNPV病毒的拷贝数，证明HEKG中的病毒含量确实远低于正常932。(8)调查EKG、HEKG和正常932的经济性状，各系统雌雄各随机抽取15颗茧，分别称取每颗茧的全茧量和茧壳量，计算茧层率，确定转基因系统的经济性状没有受到影响。本发明的技术方案为
增强子Hr3在提高hycu-印32蛋白表达量中的应用，所述增强子Hr3的核苷酸序列如 SEQ ID NO :1 所示。优选的，增强子Hr3在介导39kP启动子提高hycu-印32蛋白表达量中的应用，所述39kP启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。增量表达载体，所述增量表达载体以转座载体pBac[3XP3-EGFP afm]为基础载体，依次连接有增强子Hr3、39kP启动子、如印32基因和终止信号序列。优选的，所述如《/-印32基因为如《/-印32基因全长序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。优选的，所述终止信号序列为SV40，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。所述的增量表达载体的制备方法，具体包括以下步骤 A) 39kP-1180载体的构建
将如SEQ ID NO: 2所示的39kP启动子用Sal I和BamH I进行双酶切，得39kP启动子酶切片段，同时用Sal I私BamH I酶切pSLfall80fa载体，得pSLfall80fa载体酶切片段，连接39kP酶切片段和pSLfalISOfa载体酶切片段，得39kP_1180载体； B ) 39kP-^cw-6'/732-1180 载体的构建
将核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的hycu-ep22基因分别用BamH /和Not I 进行双酶切，■ hycu-印 >2酶切片段，同时用I和Λ^ I酶切39kP-1180载体，得 pSLfal 180fa-39kP载体酶切片段，连接如《/_印32酶切片段和pSLfal 180fa_39kP载体酶切片段，得39迚-如《/-印32-1180载体；
C ) 39kP-A_F /-e/732-SV40-1180 载体的构建
Not /和历///双酶切含有如SEQ ID Ν0:4所示的终止信号的1180载体，得到终止信号酶切片段，同时用Λ^ I私Hind ///双酶切步骤B所得39沙-如《/-印32-1180载体，得到39迚-如《/-印32-1180酶切片段，将终止信号酶切片段和39迚-如《/-印32-1180酶切片段进行连接，得 39kP-A_F /-e/732-SV40-1180 ； D) Hr3-39kP-^cw-6'/732-SV40-l 180
将如SEQ ID NO: 1所示增强子Hr3用Afco /进行单酶切，得增强子Hr3酶切片段，同时将步骤C所得的39kP-A_F /-e/732-SV40-1180用Afco /进行单酶切，得39kP-A_F /-印32-SV40-1180酶切片段，将所述增强子Hr3酶切片段和 39kP-^cw-6'/732-SV40-l 180 酶切片段进行连接，得 Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40-1180 ； E) pBac [Hr3-39kP-^cw-6'/732-SV40-3 X P3-EGFP afm]的构建用限制性内切酶Jm /酶切步骤D所得Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40-l 180载体， 得 Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40 片段；同时用内切酶Asc / 单酶切 piggyBac[3Xp3 EGFP afm]，得 piggyBac [3 Xp3 EGFP afm]线性片段，将 Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40 片段和 piggyBac [3 Xp3 EGFP afm]连接，得增量表达载体，命名为 pBac[Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV4 0-3XP3-EGFP afm]。优选的，步骤Α)中，如SEQ ID NO: 2所示的39kP启动子的获得方式如下设计特异引物，39kP的上游引物为5' acgcgtcgaccttgacccgaagcgaaat3' , 39kP的下游引物为 R:5' cgcggatcctgttgctccggcatgttt 3'；以 BmNPV 基因组为模板进行 PCR扩增，PCR 反应条件为94°C预变性4分钟，然后94°C变性40秒、55°C退火40秒、72°C延伸20秒，共30个循环，最后72°C延伸10分钟。优选的，步骤B)中，如SEQ ID NO 3所示的hycu-印 >2的获得方式如下 如《/-印32基因序列设计特异引物，上游引物为5，cgggatccatgaagaaccaacaacag 3', 下游弓 I物为5' atagtttagcggccgcttaatttattaacatatcaaag 3'；以 HycuNPV 基因组为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为94°C预变性4分钟，然后94°C变性40秒、44°C退火 40秒、72°C延伸50秒，共30个循环，最后72°C延伸10分钟。所述的增量表达载体在制备家蚕核型多角体病毒抗性增效剂中的应用。本发明增强子Hr3在促进hycu-印32蛋白增量表达中的应用，利用转基因增量表达外源抗病毒蛋白提高家蚕对BmNPV抗性的方法，首次通过在滞育家蚕品种中转基因增量表达外源抗性蛋白来显著提高家蚕的抗性。与其他方法相比，本发明具有以下优势①使家蚕在发育的各个时期均能表达Hycu-EP32蛋白，克服正常家蚕不表达Hycu-EP32的缺陷，有利于家蚕在各个时期都能利用Hycu-EP32蛋白来抑制病毒的增殖；②巧妙的利用诱导型启动子39kP和增强子Hr3的组合，使转基因家蚕在正常情况下基本不表达Hycu-EP32蛋白， 当BmNPV侵染家蚕的时候才表达该蛋白，而且利用病毒增殖产生的IEl蛋白激活Hr3增强子来大量表达该蛋白，使该蛋白的表达量随着病毒量的增加而增加，所以能最大程度减少表达外源蛋白对家蚕正常生理活动和经济性状的影响，同时还能显著提高家蚕的抗性；③ 滞育性转基因系统不需要连续饲养，保存和管理方便，而且品种资源丢失的风险低；④和传统育种手段相比，本发明通过转基因制备抗性品种不但效果好而且周期短。
图1为增量表达如《/-印32的转基因载体pb-EKG、pb-HEKG的结构示意图。图2为RT-PCR检测hycu-印 >2在EKG、HEKG-A, HEKG-B和正常932中的表达量的琼脂糖凝胶电泳图；印32代表如《/-印32，sw2^34代表内参基因；PCR检测同一个模板， ep32扩增28个循环，sw229;34扩增25个循环。图3为EKG、HEKG-A, HEKG-B、正常932品种和不攻毒对照的死亡率统计结果；各系统在3龄起蚕以半致死剂量(3X IO5多角体/头)单头经口添食BmNPV病毒。
图4为EKG、HEKG-B和正常932品种添食病毒后Oh和48h，hycu-印 >2在各系统中表达量的定量PCR检测结果。图5为攻毒后4 ，EKG、HEKG-B和正常932各系统体内BmNPV病毒含量的定量PCR 检测结果。图6为EKG、HEKG-A, HEKG-B和正常932各系统雌雄全茧量统计结果。图7为EKG、HEKG-A, HEKG-B和正常932各系统雌雄茧层率统计结果。
具体实施例方式就分子生物学领域中，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New YorkiCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明通过构建病毒39kP诱导型启动子以及39kP启动子+Hr3增强子分别介导 hycu-ep-il基因的增量表达载体；结合蚕卵低温催青解除滞育方法，利用家蚕胚胎显微注射技术，制备了 3个家蚕实用品种转基因系统；通过RT-PCR检测证明外源如印32基因在3个转基因系统中成功表达，而正常家蚕品种中没有该基因；通过经口添食病毒的抗性检测方法，结果发现和正常932系统相比，EKG系统(使用39kP启动子)没有降低死亡率，而 HEKG系统(使用39kP启动子+Hr3增强子)则降低了 30%左右的死亡率，抗性效果明显；通过定量定PCR检测发现，在正常情况下，如印32基因在HEKG系统中的表达量是EKG系统中的11. 9，在攻毒后48h，hycu-ep-il在HEKG系统中的表达为EKG系统中的48. 5倍，HEKG 系统中hycu-印？>2的表达量能够随着病毒的增殖而增加，而EKG系统中hyCuiP >2的表达量基本不受病毒的诱导；通过定量定量PCR检测发现，在食下病毒量一致的情况下，在攻毒后48h，BmNPV病毒的拷贝数在EKG和正常932中没有明显区别，而在HEKG-B中的含量仅为正常932中的30%左右；经济性状调查结果显示，EKG、HEKG和正常932各个系统的全茧量没有区别，茧层率也没有区别，说明表达外源如《/_印32基因没有影响家蚕的经济性状。本发明通过使用39kP启动子+Hr3增强子，成功表达外源如印32，并且使如印32的表达量随着病毒含量的增加而增加，在显著提高家蚕抗性的同时没有影响其经济性状。实施例1 构建转基因增量表达载体 pBac [39kP-^c -6'/732-SV40-3 X P3-EGFP afm]和 pBac [Hr3-39kP-^cw-6'/732-SV40-3 X P3-EGFP afm]
(1)根据已经报道的BmNPV 39kP启动子序列(如SEQ ID NO: 2所示)设计特异弓丨物，弓丨物序歹丨J 如下39kP F: 5' acgcgtcgaccttgacccgaagcgaaat3' , 39kP R:5' cgcggatcctgttgctccggcatgttt 3'，设计的引物委托生工生物工程(上海)有限公司进行合成。以BmNPV基因组为模板，以设计的39kP F和39kP R为上下游引物进行PCR扩增，PCR反应条件为94 V预变性4分钟，然后94°C变性40秒、55 °C退火40秒、72 °C延伸20秒，共30个循环，最后72°C延伸10分钟；PCR产物(如SEQ ID NO: 2所示)用5 //和及 /7/进行双酶切，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得39kP酶切片段，同时用Sal I私BernH I酶切pSLfall80fa 载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得PSLfalISOfa载体酶切片段，连接39kP酶切片段和 pSLfallSOfa载体酶切片段，连接反应在T4 DNA连接酶作用下，16°C过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，在含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定片段大小，得含有 39kP 的 pSLfall80fa 载体(简称 39kP_1180)。(2)根据印32基因序列设计特异引物，引物序列如下:印32 F: 5’ cgggatccatgaagaaccaacaacag 3’，hycu~ep >2 R: 5’ atagtttagcggccgcttaatttattaac atatcaaag 3’，设计的引物委托生工生物工程(上海)有限公司进行合成。以HycuNPV基因组为模板，以设计的如《/-印32 F、hycu-印·为上下游引物进行PCR扩增，PCR反应条件为94°C预变性4分钟，然后94°C变性40秒、44°C退火40秒、72°C延伸50秒，共30个循环，最后72°C延伸10分钟；PCR产物(如SEQ ID NO: 3所示)分别用BamH I私Not /进行双酶切，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得如印32酶切片段，同时用/和Λ^ /酶切39kP-1180载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pSLfall80fa-39kP载体酶切片段，连後hycu-印 >2酶切片段和pSLfall80fa-39kP载体酶切片段，转化后筛选阳性克隆，得含有 hycu~ep >2基因和39kP启动子的pSLfall80fa载体(简称39迚-如《/-印32-1180)。(3)用舱 /和Hind ///双酶切已经含有SV40终止信号(如SEQ ID NO: 4所示)的 1180载体得到SV40酶切片段，同时用Afoi I琳Hind ///双酶切39迚-如《/-印32-1180载体得到39迚-如《/-印32-1180酶切片段，将SV40酶切片段和39迚-如《/-印32-1180酶切片段进行连接转化，筛选阳性克隆得到含有39kP启动子、如印32基因和SV40终止信号的 pSLfall80fa 载体(简称 39kP-A_F /-e/732-SV40-1180)。(4)将增强子Hr3序列(如SEQ ID NO: 1所示)用Afco /进行单酶切，回收得到Hr3酶切片段，同时将39kP-Aj^/-e/732-SV40-l 180用Afco /进行单酶切回收得到 39kP-A_F /-e/732-SV40-l 180 酶切片段，将 Hr3 酶切片段和 39kP-A_F /-e/732-SV40-l 180 酶切片段进行连接转化，筛选阳性克隆，得到Hr3增强子、39kP启动子、如印32基因和SV40 终止信号的 pSLfall80fa 载体(简称 Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40-1180)。(5)用限制性内切酶 Asc I 分别酶切 39kP-A_F /-e/732-SV40-1180 和Hr3-39kP-如《/-e/732-SV40-1180载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得 39kP-A_F /-e/732-SV40 和 Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40 片段；同时用内切酶 Jse / 单酶切 PiggyBac[3Xp3 EGFP afm]，的 piggyBac[3Xp3 EGFP afm]线性片段，然后对获得 piggyBac [3 X p3 EGFP afm]线性片段 5，端去磷酸化，连接 39kP-A_F /-e/732-SV40 和 piggyBac [3 Xp3 EGFP afm]，转化后筛选阳性克隆，得到重组载体pBac [39迚-如《/-印32-SV40-3XP3-EGFP afm] (pb-EKG)；将 Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40 片段和 piggyBac[3Xp3 EGFP afm]连接转化，筛选阳性克隆，得到重组载体pBac [Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40-3XP3 -EGFP afm] (pb-HEKG)，如图 1 所示。实施例2 转基因显微注射和阳性个体的筛选
(1)将家蚕932品种蚕卵浸酸(所用盐酸比重为1.073，温度为46°C，时间为5分钟)解除滞育以后，放于15°C和80%湿度的黑暗环境中催青30天左右直至孵化，将蚁蚕收好置于标准环境中饲养(温度25°C，湿度80%)，化蛾以后将雌雄蚕蛾交配4小时，拆对后产下的蚕卵为非滞育蚕卵，用于下一步的显微注射；
(2)将产下的蚕卵在干净的载玻片上排列整齐，在蚕卵产后2小时用Eppendorf显微注射仪将Pb-EKG重组载体和辅助质粒A3H，一起注射进91粒932蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25°C、相对湿度80%的环境中催青10天左右孵化，将孵化的25头GO代蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾，GO代蚕蛾通过自交或回交共获得6蛾圈Gl代蚕卵，用Olympus 电动宏观荧光显微镜观察Gl胚胎筛选并获得1个阳性蛾圈，即1个39kP启动子介导的外源Hycu-EP32 蛋白表达的转基因家蚕，简称EKG转基因系统，转化效率为16. 67% ；将含有pb-HEKG重组载体和辅助质粒A3H，一起注射进183粒932蚕卵中，共孵化47头GO代蚁蚕，获得13蛾圈Gl 代蚕卵，筛选得到8个阳性蛾圈，即8个Hr3+39kP启动子介导的外源Hycu-EP32蛋白表达的转基因家蚕，简称HEKG转基因系统，转化效率为61. 54%.(3 )将获得的一个EKG阳性蛾圈和随机选择的两个HEKG阳性蛾圈(HEKG-A和 HEKG-B)各自单蛾圈饲养，继代扩大。实施例3 =RT-PCR检测hycu-印说在EKG、HEKG和正常932中的表达量
(1)将实施例2制备的EKG、HEKG-A,HEKG-B和正常932进行正常饲养，在3龄起蚕、3 龄眠蚕、4龄起蚕和4龄眠蚕各取5头幼虫提取总RNA (Total RNA (Mini) Kit，Watson)， 用DNA酶消化处理后各自取4 μ g的RNA反转录成25 μ 1的cDNA，最后各自稀释到100 μ 1 用于下步检测。(2)利用家蚕内参基因特异引物 sw22934 F 5' ttcgtactggctcttctcgt 3', sw22934 R 5' caaagttgatagcaattccct 3'，取上述的 16 个 cDNA 模板各 1 μ 1 进行 RT-PCR 检测，PCR反应条件为94°C预变性4分钟，然后94°C变性40秒、58°C退火40秒、72°C延伸 10秒，共25个循环，最后72°C延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，如图2所示， 发现各个模板都扩增出目的条带，而且条带大小粗细程度比较均一，说明这16个cDNA模板是可用的。(3)利用印32 的特异检测引物印32 QRT F: 5，acatcagaatacccatcacg 3，， 印32 QRT R: 5，attgttcaatggtaactccc 3，，取上述的 16 个 cDNA 模板各 1 μ 1 进行 RT-PCR 检测，PCR反应条件为94°C预变性4分钟，然后94°C变性40秒、58°C退火40秒、72°C延伸 10秒，共观个循环，最后72°C延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，发现除了正常932的4个模板，在EKG、HEKG-A和HEKG-B的所有模板中都扩增出目的条带，如图2所示。这个结果证明正常家蚕体内确实不含有如印32基因，而如印32基因成功在我们所制备的转基因系统中表达。实施例4 转基因系统的抗性检测
(1)取转基因系统EKG、HEKG-A、HEKG-B和正常932品种，在3龄起蚕时期以半致死剂量(3X IO5多角体/头)单头经口添食BmNPV病毒，4个系统各设置3个重复区，每个重复区 100头蚕，同时每个系统设置3个不攻毒对照区，连续10天统计死亡率；
(2)抗性检测结果如图3所示，EKG、HEKG-A、HEKG-B和正常932的死亡率分别为 55. 47%,24. 29%,24. 50%,50. 50%。转基因系统EKG的死亡率和正常932系统没有明显区别； 转基因系统HEKG-A和HEKG-B的死亡率明显低于正常932系统，能降低26%左右的死亡率。(3)根据抗性检测结果，我们发现增量表达外源Hycu-EP32蛋白确实能提高家蚕对BmNPV病毒的抗性，而且Hr3+39kP的启动子效率明显优于39kP的启动子效率。实施例5 定量PCR检测hycu-印？>2在攻毒后的的表达量变化情况
(1)在3龄起蚕(设为攻毒Oh)和攻毒后48h，EKG、HEKG-B和正常932每个系统各取10 头蚕，提取总RNA然后反转录成cDNA。以如《/-印32基因的特异引物ep32 QRT进行定量PCR 检测(试剂盒为 SYBR Premix Ex Taq Kit，TaKaRa ；定量PCR检测仪器为 ABI StepOnePlus Real-Time PCR System,Applied Biosystems ；按照试剂盒和仪器使用说明书进行操作);以家蚕看家基因BGIBMGA003186-TA作为内参，检测引物为sw22934。(2)根据定量PCR的结果如图4所示，我们发现在正常情况下，hycu-ep ,2在 HEKG-B中的表达量是EKG中的11. 9倍；在攻毒后48h，A_F /-e/732在EKG中的表达量为攻毒前的1. 3倍,hycm-印 >2在HEKG-B中的表达量为攻毒前的5. 4倍；在攻毒后4811，如《/-印32 在HEKG-B中的表达量为EKG中的48. 5倍。(3)从以上的定量PCR结果，我们可以看出，39kP启动子被病毒诱导表达的能力很弱(1. 3倍)，导致EKG不能增强家蚕的抗性，这说明39kP启动子单独作为一个启动子使用基本不具备应用价值；但是，如果把Hr3增强子和39kP启动子联合一起使用(Hr3+39kP)， 则可以明显提高启动子的活性，在正常情况下可以比较明显的提高启动子活性(增强11.9 倍)，更重要的是，Hr3+39kP在攻毒后的活性大大增加，达到了 39kP的48. 5倍。这些结果说明由于使用Hr3+39kP启动子，我们的HEKG系统在正常情况下可以表达适量的印32，在攻毒后则随着病毒量的增加而增加印32的表达量，这使HEKG系统的经济性状没有受到影响， 同时还大大提高了抗性。实施例6 定量PCR检测攻毒后各系统中BmNPV病毒的含量
(1)在攻毒后48h，EKG、HEKG-B和正常932每个系统各取10头蚕提取总DNA。每个 DNA模板各取20 ng,以BmNPV病毒甜W基因的特异引物进行定量PCR检测，引物为GP41 F: 5 ‘cgtagtagtagtaatcgccgc3‘, GP41 R: 5 ^agtcgagtcgcgtcgctttS',(试剂盒为 SYBR Premix Ex Taq Kit，TaKaRa ；定量 PCR 检测仪器为 ABI StepOnePlus Real-Time PCR System, Applied Biosystems ；按照试剂盒和仪器使用说明书进行操作)；以家蚕看家基因彻似/W为内参，引物为 BmGAPDH F: 5 ‘ gctgcctccttgaccttttgc3，，BmGAPDH R: 5 ‘ cattccgcgtccctgttgctaat 3'。(2)定量PCR的结果如图5所示，正常932体内的病毒含量被设置为100%，EKG和 HEKG-B体内的病毒含量分别为110. 89%和28. 39%。从该图我们可以发现，在食下病毒量一致的情况下，在攻毒后48h，BmNPV病毒的拷贝数在EKG和正常932中没有明显区别，而在 HEKG-B中的含量则远远低于正常932中的含量。(3) BmNPV病毒拷贝数的检测结果说明，HEKG-B系统明显抑制了 BmNPV病毒在其体内的复制增殖，这也解释了为什么HEKG-B的死亡率明显降低；EKG不能抑制病毒在其体内的增殖，所以不能降低死亡率。实施例7 调查转基因系统的经济性状
(1) EKG、HEKG-A, HEKG-B和正常932各系统雌雄各自随机抽取15颗茧，分别称取每颗茧的全茧量和茧壳量。(2)统计的全茧量结果如图6所示EKG、HEKG-A、HEKG-B和正常932的全茧量分别为 1. 007g、l. 361g、l. 353、1. 197(雄)，和 1. 279g、1. 749g、1. 638g、1. 497g(雌)。结果显示转基因系统和正常932之间没有明显区别
(3)计算出的茧层率结果如图7所示EKG、HEKG-A、HEKG-B和正常932的茧层率分别为 22. 21%, 23. 94%, 24. 49%, 23. 18% (雄)，禾口 19. 50%、19. 75%, 21. 20%, 20. 36% (雌)。结果也显示转基因系统和正常932之间没有明显区别。(4)以上调查结果显示转基因增量表达如印32不会影响家蚕的经济性状。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.增强子Hr3在提高hycu-印32蛋白表达量中的应用，所述增强子Hr3的核苷酸序列如 SEQ ID NO :1 所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，增强子Hr3在介导39kP启动子提高 hycu-印32蛋白表达量中的应用，所述39kP启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.增量表达载体，其特征在于，所述增量表达载体以转座载体pBac[3XP3-EGFPafm] 为基础载体，依次连接有增强子Hr3、39kP启动子、如印32基因和终止信号序列。
4.根据权利要求3所述的增量表达载体，其特征在于，所述如《/_印32基因为如《/-印32基因全长序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根据权利要求3所述的增量表达载体，其特征在于，所述终止信号序列为SV40，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
6.权利要求3所述的增量表达载体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤A) 39kP-1180载体的构建将如SEQ ID NO: 2所示的39kP启动子用Sal I和BamH I进行双酶切，得39kP启动子酶切片段，同时用Sal I私BamH I酶切pSLfall80fa载体，得pSLfall80fa载体酶切片段，连接39kP酶切片段和pSLfalISOfa载体酶切片段，得39kP_1180载体；B ) 39kP-^cw-6'/732-1180 载体的构建将核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的hycu-ep22基因分别用BamH /和Not I 进行双酶切，■ hycu-印 >2酶切片段，同时用I和Λ^ I酶切39kP-1180载体，得 pSLfal 180fa-39kP载体酶切片段，连接如《/_印32酶切片段和pSLfal 180fa_39kP载体酶切片段，得39迚-如《/-印32-1180载体；C ) 39kP-A_F /-e/732-SV40-1180 载体的构建Not /和历///双酶切含有如SEQ ID Ν0:4所示的终止信号的1180载体，得到终止信号酶切片段，同时用Λ^ I私Hind ///双酶切步骤B所得39沙-如《/-印32-1180载体，得到39迚-如《/-印32-1180酶切片段，将终止信号酶切片段和39迚-如《/-印32-1180酶切片段进行连接，得 39kP-A_F /-e/732-SV40-1180,如 SEQ ID NO:5 所示；D)Hr3-39kP-^cw-6'/732-SV40-l 180将如SEQ ID NO: 1所示增强子Hr3用Afco /进行单酶切，得增强子Hr3酶切片段，同时将步骤C所得的39kP-A_F /-e/732-SV40-1180用Afco /进行单酶切，得39kP-A_F /-印32-SV40-1180酶切片段，将所述增强子Hr3酶切片段和 39kP-^cw-6'/732-SV40-l 180 酶切片段进行连接，得 Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40-1180，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；E)pBac [Hr3-39kP-^cw-6'/732-SV40-3 X P3-EGFP afm]的构建用限制性内切酶Jm /酶切步骤D所得Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40-l 180载体， 得 Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40 片段；同时用内切酶Asc / 单酶切 piggyBac[3Xp3 EGFP afm]，得 piggyBac [3 Xp3 EGFP afm]线性片段，将 Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40 片段和 piggyBac [3 Xp3 EGFP afm]连接，得增量表达载体，命名为 pBac[Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV4 0-3XP3-EGFP afm]。
7.根据权利要求6所述的增量表达载体的制备方法，其特征在于，步骤Α)中，如SEQID N0:2所示的39kP启动子的获得方式如下设计特异引物，39kP的上游引物为5’ acgcgtcgaccttgacccgaagcgaaat3' , 39kP 的下游弓|物为R: 5' cgcggatcctgttgctccggcatgttt 3'；以BmNPV基因组为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为94°C预变性4分钟，然后94°C 变性40秒、55°C退火40秒、72°C延伸20秒，共30个循环，最后72°C延伸10分钟。
8.根据权利要求6所述的增量表达载体的制备方法，其特征在于，步骤B)中，如SEQ ID N0:3所示的如印32的获得方式如下如印32基因序列设计特异引物，上游引物为5' cgggatccatgaagaaccaacaacag 3' , T"￠1^141 5' atagtttagcggccgcttaatt tattaacatatcaaag 3'；以HycuNPV基因组为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为94°C预变性4分钟，然后94°C变性40秒、44°C退火40秒、72°C延伸50秒，共30个循环，最后72°C 延伸10分钟。
9.权利要求3所述的增量表达载体在制备家蚕核型多角体病毒抗性增效剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及家蚕的转基因技术，具体为增强子Hr3在提高hycu-ep32蛋白表达量中的应用；所述增量表达载体以转座载体pBac[3×P3-EGFPafm]为基础载体，依次连接有增强子Hr3、39kP启动子、hycu-ep32基因和终止信号序列；本发明转基因增量表达外源抗病毒蛋白制备抗BmNPV家蚕品种，首次通过在滞育家蚕品种中转基因增量表达外源抗性蛋白提高家蚕的抗性；其在发育的各个时期均能表达Hycu-EP32蛋白，克服正常家蚕不表达Hycu-EP32的缺陷，有利于家蚕在各个时期都能利用Hycu-EP32蛋白来抑制病毒的增殖；该蛋白的表达量随着病毒量的增加而增加，所以能最大程度减少表达外源蛋白对家蚕正常生理活动和经济性状的影响，同时还能显著提高家蚕的抗性。
文档编号A01K67/04GK102492691SQ20111042327
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者夏庆友, 徐汉福, 王根洪, 程廷才, 蒋亮, 金盛凯 申请人:西南大学