专利名称：一种梅花叶片愈伤组织高效诱导方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种梅花愈伤组织高效诱导的方法。
背景技术：
梅花(Primus mume Sieb. Et Zucc.)是中国的传统名花，品种繁多，种质资源丰富。它原产于我国西南地区及长江流域、珠江流域，以川、滇、藏为中心，在我国有7000年以上的应用史和3000年以上的栽培史。引种栽培过程中，培育出了众多优良的园艺新品种， 极大地丰富了我国的园林景观。梅花从受粉到果实成熟仅要两三个月左右的时间，果实发育时间短，其果实达到成熟时，胚尚未成熟。种子经过砂藏处理，在正常条件下播种萌发率也很低。胚培养技术可以挽救胚败育和发育不良，缩短休眠期，无需沙藏，极大地提高胚的萌发率及成苗率。潘晓等对‘淡丰后’杏梅品种的胚培养做了初步研究，显著提高了种子的成苗率，但观赏价值高的真梅品种在该研究中未有涉及。愈伤组织一方面可研究植物生长发育及分化的机制、遗传变异规律，对植物遗传育种具有特殊意义；另一方面可用于大规模工厂化生产有用化合物，或用于细胞培养筛选工业、农业、医药生产上有用的无性系，或用于原生质体培养中的原生质体来源等。实践证明，愈伤组织培养不仅是一种植物快繁的新手段，同时也是植物改良，种质保存和有用化合物生产的理想途径。而木本植物外植体污染率比较高，并且木本植物愈伤组织的诱导具有一定的困难。梅花组织培养研究中，通过叶片进行愈伤组织诱导少见报道，高效的愈伤组织诱导体系更是少人问津。
发明内容
本发明的目的在于提供一种梅花叶片愈伤组织高效诱导方法。为实现本发明目的，本发明提供了一种梅花叶片愈伤组织诱导方法，其为以真梅系梅花品种胚培养获得的实生苗的幼嫩叶片为外植体，近轴面朝上接入愈伤组织诱导培养基，暗培养2周以上，所述的愈伤组织诱导培养基优选为MS+蔗糖20 40g/L+2，4-D0. 25 2. 00mg/L, pH = 5. 8 6.0的固体培养基，更优选为MS+蔗糖20 40g/L+2，4-D0. 5 1. 5mg/L，pH = 5. 8 6. 0 的固体培养基，更优选为 MS+ 蔗糖 20 40g/L+2，4-D1. 0mg/L，pH =5. 8 6.0的固体培养基。其中，幼嫩叶片在接种前，去掉叶柄，用刀片沿主脉划2 3刀，保证叶缘处相连目的在于使叶片产生更多的伤口，促进愈伤组织的诱导。其中，所述幼嫩叶片优选为实生苗长至6 8片叶片时，从上往下数第3 4片叶片。在本发明一个优选的实施方案中，胚培养包括如下步骤1)取开花后50 70天未成熟的梅花果实，用0. 5 1. 5%的高锰酸钾溶液清洗外果皮并浸泡1 池，之后流水冲洗1 ai ；
2)砸碎果实，取出种子，并用流水清洗去掉种皮；3)将步骤2)去掉种皮的种子用70%的乙醇浸泡20 40s，升汞浸泡8 15min，无菌水冲洗至少3次后备用；4)将步骤3)表面灭菌后的种子保留部分子叶，接种于MS+0. 5 1. 5mg/ L6-BA+0. 1 0. 3mg/L IBA+蔗糖20 40g/L，pH = 5. 8 6. 0的固体实生苗诱导培养基中，暗培养1 3周后，进行光照培养，光照强度为2000 3000Lx，光照时间为14h/d。其中，优选的梅花果实为开花后60天未成熟的果实。其中，优选的固体实生苗诱导培养基为MS+1. 0mg/L6-BA+0. 2mg/LIBA+蔗糖20 40g/L，pH = 5. 8 6. 0的固体培养基。本发明中建立了梅花叶片愈伤组织高效诱导的培养体系，该体系的建立，能够高效的诱导愈伤组织，使叶片愈伤组织的诱导率达90%以上。此外，本发明建立了梅花胚培养体系，实现无菌苗长期保存。用无菌实生苗的幼嫩叶片为外植体，解决了愈伤组织外植体来源的问题。
图1所示为梅花胚培养无菌苗植株。图2所示为梅花叶片愈伤组织诱导结果。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1梅花外植体的采集及消毒春季采集真梅系梅花品种‘淡寒红’果实，清水洗净。配制的高锰酸钾溶液置于2L的大烧杯中，浸泡清洗外果皮lh，流水冲洗Ih直至水澄清为止。用石制研钵轻砸，去掉果肉，轻砸内果皮，取完整饱满的种子，用清水浸泡去掉种皮，胚培养备用。接种时消毒， 用70%酒精浸泡种子30s，升汞浸泡lOmin，无菌水冲洗3次，接种备用。实施例2梅花种子的胚培养将实施例1灭菌过的种子放在无菌滤纸上，吸干种子表面的水；用镊子将子叶分离，用刀片切割带胚的子叶的下半部分，去掉其中的一片子叶以及另一片子叶的1/2，然后将外植体接种于含有40ml培养基的IOOml锥形瓶中，每瓶接种3个外植体，培养基配方为 MS+O. 5-1. 5mg/L 6-BA+0. 1-0. 3mg/L IBA (见表 1)，其中添加了浓度 30g/L 的蔗糖，7g/L 的琼脂；将培养瓶置于黑暗条件下，25 士 3°C培养两周时间，再转入光培养，培养两周。光培养条件为光照强度2000 3000Lx，光照时间14h/d。接种一个月左右即可得到无菌苗。个激素浓度与萌发率结果见表1。表1不同激素组合对胚培养的影响
权利要求
1.一种梅花叶片愈伤组织诱导方法，其为以真梅系梅花品种胚培养获得的实生苗的幼嫩叶片为外植体，近轴面朝上接入愈伤组织诱导培养基，暗培养2周以上，所述的愈伤组织诱导培养基为MS+蔗糖20 40g/L+2，4-D 0. 25 2. 00mg/L，pH = 5. 8 6. 0的固体培养基。
2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，其中幼嫩叶片在接种前，去掉叶柄， 用刀片沿主脉横切2 3刀，保证叶缘处相连。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述幼嫩叶片为实生苗长至6 8片叶片时，从上往下数第3 4片叶片。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，胚培养包括如下步骤1)取开花后50 70天未成熟的梅花果实，用0.5 1. 5%的高锰酸钾溶液清洗外果皮并浸泡1 池，之后流水冲洗1 池；2)砸碎果实，取出种子，并用流水清洗去掉种皮；3)将步骤2、去掉种皮的种子用70%的乙醇浸泡20 40s，升汞浸泡8 15min， 无菌水冲洗至少3次后备用；4)将步骤3)表面灭菌后的种子保留部分子叶，接种于MS+0.5 1. 5mg/L6-BA+0. 1 0. 3mg/L IBA+蔗糖20 40g/L，pH = 5. 8 6. 0的固体实生苗诱导培养基中，暗培养1 3周后，进行光照培养，光照强度为2000 3000Lx，光照时间为14h/d。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的固体实生苗诱导培养基为 MS+1. 0mg/L6-BA+0. 2mg/LIBA+ 蔗糖 20 40g/L。
6.根据权利要求1 5任一项所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基为 MS+ 蔗糖 20 40g/L+2，4-D0. 5 1. 5mg/L, pH = 5. 8 6. 0 的固体培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基为MS+蔗糖 20 40g/L+2，4-Dl. Omg/L, pH = 5. 8 6. 0 的固体培养基。
全文摘要
本发明提供一种梅花叶片愈伤组织诱导方法，其为以真梅系梅花品种胚培养获得的实生苗的幼嫩叶片为外植体，近轴面朝上接入愈伤组织诱导培养基，暗培养2周以上，所述的愈伤组织诱导培养基为MS+蔗糖20～40g/L+2，4-D 0.25～2.00mg/L，pH＝5.8～6.0的固体培养基。本发明中建立了梅花叶片愈伤组织高效诱导的培养体系，该体系的建立，能够高效的诱导愈伤组织，使叶片愈伤组织的诱导率可达90％以上，而且愈伤组织的增殖量大。
文档编号A01H4/00GK102550404SQ20111042221
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者张启翔, 杨炜茹, 石文芳, 陈晶鑫 申请人:北京林业大学