尿液处理方法和气相色谱-质谱检测尿液甲基丙二酸的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及尿液处理方法和尿液有机酸，特别是尿液甲基丙二酸的检测方法。
【背景技术】
[0002]甲基丙二酸血症(MMA)，又称为甲基丙二酸尿症，是一种常染色体隐性遗传的代谢性疾病，是有机酸血症中最常见的类型。其发病原因是由于甲基丙二酰辅酶A转化为琥珀酰辅酶A的代谢过程中出现障碍，从而导致体内甲基丙二酰辅酶A、甲基丙二酸、丙酸等有机酸蓄积，引发代谢性酸中毒，损害神经系统，严重者可引起酮症酸中毒、低血糖、高血氨、高甘氨酸血症等，新生儿、婴幼儿期的病死率很高。
[0003]然而，由于有机酸代谢病临床表现复杂，且症状均为非特异性的，临床诊断较为困难，需要依赖质谱检测技术进行筛查。目前，甲基丙二酸血症的诊断主要采用两种方法:使用串联质谱法检测滤纸干血片酰基肉碱的方法和气相色谱-质谱(GC-MS)联用检测尿液甲基丙二酸的方法。但是，在串联质谱滤纸干血片检测中，即使检测结果显示酰基肉碱的含量升高，患者仍存在患有甲基丙二酸血症或丙酸血症两种病症的可能性，诊断的特异性不高，容易出现误诊或错诊。因此，GC-MS联用检测尿液有机酸的方法是辅助诊断甲基丙二酸血症的主要手段，能够诊断多数的有机酸代谢疾病。
[0004]现有技术的GC-MS联用尿液有机酸检测通常包括如下步骤:取一定量的尿样，加入尿素酶去除尿素后加入内标并定容，调节PH值，加入盐酸羟胺进行反应，之后进行酸碱中和，萃取、干燥后进行衍生化反应，以及样品上机进行有机酸检测。检测的仪器条件一般为:
[0005]1.GC 部分
[0006]进样方式:分流模式；
[0007]分流比:10:1;
[0008]进样口温度:280 °C;
[0009]升温程序:100°C保持4分钟，以4°C /分钟的升温速率升至280°C，保持11分钟；
[0010]流量控制模式:恒线速度。
[0011]2.MS 部分
[0012]离子源温度:200 °C ;
[0013]接口温度:280 °C;
[0014]采样方式:Scan ；
[0015]间隔:0.50s;
[0016]扫描速度:1000;
[0017]开始扫描离子质核比(m/z):50 ；
[0018]结束扫描离子质核比(m/z):500。
[0019]上述检测方法中，样品上机前的整个前处理周期需要5-6个小时，同时样品分析周期也长，一般需要I小时左右。这么长的前处理和检测周期有可能会延误甲基丙二酸血症患儿的诊断、治疗甚至抢救。
[0020]综上，鉴于甲基丙二酸血症在有机酸代谢疾病中的发病率高，会造成患儿不可逆的神经损害等严重后果，串联质谱法滤纸干血片检测的敏感指标与丙酸血症相似，特异性不高，不易确诊；而作为目前主要检测手段的GC-MS联用尿液有机酸检测耗时长，可能会延误最佳治疗时机。因此，需要找到一种快速、准确的检测尿液甲基丙二酸的方法。
【发明内容】
[0021]针对现有串联质谱法滤纸干血片检测和GC-MS联用尿液甲基丙二酸检测方法的缺陷，本发明的目的在于通过简单的尿液前处理方法、以及优化气相色谱和质谱的仪器条件，从而实现尿液甲基丙二酸的快速检测。
[0022]本发明提供一种尿液处理方法，包括以下步骤:取一定量的尿样，加入内标及冰冻无水乙醇，充分震荡混合均匀，离心处理去除蛋白，取上清液，氮吹至完全干燥，加入衍生化试剂进行反应。
[0023]优选本发明的尿液处理方法中所述一定量的尿样含0.2毫克肌酐。
[0024]优选本发明的尿液处理方法中所述内标为托品酸。
[0025]优选本发明的尿液处理方法中所述冰冻无水乙醇为2.0ml。
[0026]优选本发明的尿液处理方法中所述离心在4000rpm下进行5分钟。
[0027]优选本发明的尿液处理方法中所述氮吹在60°C条件下进行。
[0028]优选本发明的尿液处理方法中所述衍生化反应使用双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺:三甲基氯硅烷为99:1的硅烷化试剂，在70°C条件下进行。
[0029]本发明还提供一种气相色谱-质谱检测尿液甲基丙二酸的方法，包括本发明的尿液处理方法，以及在下述气相色谱和质谱仪器条件下上机检测。
[0030]1.气相色谱部分
[0031]进样方式:分流模式；
[0032]分流比:10:1;
[0033]进样口温度:280 °C;
[0034]升温程序:120°C保持2分钟，以10°C /分钟的升温速率升至180°C，保持1.5分钟
[0035]流量控制模式:恒线速度。
[0036]2.质谱部分
[0037]离子源温度:200°C ；
[0038]接口温度:280 °C;
[0039]采样方式:Scan ；
[0040]间隔:0.50s;
[0041]扫描速度:1000;
[0042]开始扫描离子质核比(m/z):50 ；
[0043]结束扫描离子质核比(m/z):300。
[0044]本发明的尿液处理方法不需要经尿素酶处理去除尿素，并且通过离心去除蛋白，操作简单易行，大大节省了样本处理时间。此外，本发明的尿液甲基丙二酸检测方法能够达到较高的精确度和准确度，是一项简便、快捷、准确的检测方法，可以用于有机酸血症，特别是甲基丙二酸血症的诊断及治疗效果监测。
【附图说明】
[0045]图1是通过现有技术的尿液有机酸检测方法测得的正常新生儿GC-MS图谱。
[0046]图2是通过现有技术的尿液有机酸检测方法测得的甲基丙二酸血症患儿GC-MS图
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[0047]图3是通过本发明的尿液甲基丙二酸检测方法测得的正常新生儿GC-MS图谱。
[0048]图4是通过本发明的尿液甲基丙二酸检测方法测得的甲基丙二酸血症患儿GC-MS图谱。
【具体实施方式】
[0049]为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明做更详细的说明。
[0050]实施例1尿液的处理
[0051]采集正常新生儿和甲基丙二酸血症患儿尿液，按照以下步骤进行处理:(1)采用紫外分光光度法测定尿液中的肌酐含量，取相当于0.2毫克肌酐的尿样；(2)加入内标2-苯基-3-羟基丙酸(托品酸)及2.0ml冰冻无水乙醇，用自动振动器充分震荡混合均匀；
(3)用离心分离机以4000rpm离心5分钟去除蛋白；(4)将上清液转移，在60°C条件下用氮吹仪氮吹至完全干燥；(5)在70°C条件下，向干燥残余物中加入双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA):三甲基氯硅烷(TMCS)为99:1的硅烷化试剂进行30分钟衍生化反应。整个处理过程需要约I小时。
[0052]对比例I尿液的处理(现有技术方法)
[0053]采集正常新生儿和甲基丙二酸血症患儿尿液，按照以下步骤进行处理:(I)采用紫外分光光度法测定尿液中的肌酐含量，取相当于0.2毫克肌酐的尿样；(2)加入30μ1尿素酶(IKU)充分振荡后，在37°C条件下，静置30分钟去除尿素，然后加入40 μ I内标托品酸并定容至2.0ml ；(3)调节PH至12，加入盐酸羟胺充分反应后，加入600 μ I浓度为37%的盐酸，充分振荡，进行10分钟酸碱中和；(4)使用6ml乙酸乙酯进行萃取后，在60°C条件下使用氮吹仪氮吹至完全干燥；(5)在70°C条件下加入100 μ I的BSTFA:TMCS (99:1)进行30分钟衍生化反应。整个处理过程需要约5小时。
[0054]实施例2对处理过的尿液进行检测
[0055]将经如上前处理的尿样分别用现有的GC-MS尿液有机酸检测法和本发明的GC-MS尿液甲基丙二酸检测法上机检测。
[0056]现有GC-MS尿液有机酸检测法的仪器条件如下:
[0057]1.GC 部分
[0058]进样方式:分流模式；
[0059]分流比:10:1;
[0060]进样口温度:280 °C;
[0061 ] 升温程序:100°C保持4分钟，以4°C /分钟的升温速率升至280°C，保持11分钟
[0062]流量控制模式:恒线速度；
[0063]2.MS 部分
[0064]离子源温度:200°C ；
[0065]接口温度:280 °C;
[0066]米样方式:Scan ；
[0067]间隔:0.50s;
[0068]扫描速度:1000;
[0069]开始m/z: 50;
[0070]结束m/z: 500。
[0071]检测得到的图谱如图1和图2所示，图1为正常新生儿的结果，图2为甲基丙二酸血症患儿的结果。由图1和图2可以看出，现有检测方法的检测周期约为I小时，较长。
[0072]本发明的检测方法除了如下改变GC部分的升温程序和MS部分的结束扫描离子质核比以外，其他仪器条件保持不变。
[0073]1.GC部分条件
[0074]升温程序:120°C保持2分钟，以10°C /分钟的升温速率升至180°C，保持1.5分钟；
[0075]2.MS部分条件
[0076]结束m/z: 300。
[0077]检测得到的图谱如图3和图4所示，图3为正常新生儿的结果，图4为甲基丙二酸血症患儿的结果。由图3和图4可以看出，本发明检测方法的检测周期仅约为9分钟，大幅缩短。
[0078]通过比较图2和图4可以发现，本发明检测方法中甲基丙二酸的色谱峰与现有技术方法同样容易识别，同时整个检测周期得到了大幅缩短，是一种快捷而准确的检测方法。
[0079]需要说明的是，本发明的说明书及附图中给出了本发明的较佳实施例，但这些实施例仅仅是示例性的，用于帮助理解本发明的内容，并不构成对本
【发明内容】
的任何限制。本领域技术人员根据本发明公开内容所进行的各种改变/变换，均落入本发明要求保护的范围之内。
【主权项】
1.一种尿液处理方法，其特征在于，包括以下步骤: a.取一定量的尿样， b.加入内标及冰冻无水乙醇，充分震荡混合均匀， c.离心去除蛋白； d.取上清液，氮吹至完全干燥； e.加入衍生化试剂进行反应。2.根据权利要求1的尿液处理方法，其特征在于，所述一定量的尿样含0.2毫克肌酐。3.根据权利要求1的尿液处理方法，其特征在于，所述内标为托品酸。4.根据权利要求1的尿液处理方法，其特征在于，所述冰冻无水乙醇为2.0mlo5.根据权利要求1的尿液处理方法，其特征在于，所述离心在4000rpm下进行5分钟。6.根据权利要求1的尿液处理方法，其特征在于，所述氮吹在60°C条件下进行。7.根据权利要求1的尿液处理方法，其特征在于，所述衍生化反应使用双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺:三甲基氯硅烷为99:1的硅烷化试剂，在70°C条件下进行。8.一种气相色谱-质谱检测尿液甲基丙二酸的方法，其特征在于，包括权利要求1-7中任一项的尿液处理方法，以及在下述气相色谱和质谱仪器条件下上机检测，其中 气相色谱仪器条件为: 进样方式:分流模式； 分流比:10:1 ； 进样口温度:280°c ； 升温程序:120°C保持2分钟，以10°C /分钟的升温速率升至180°C， 保持1.5分钟 流量控制模式:恒线速度。 质谱仪器条件为: 离子源温度:200°C ； 接口温度:280 0C ； 采样方式:Scan ；间隔:0.50s ； 扫描速度:1000 ； 开始扫描离子质核比m/z:50 ； 结束扫描离子质核比m/z:300。
【专利摘要】本发明公开了一种尿液处理方法，包括以下步骤：取一定量的尿样，加入内标及冰冻无水乙醇，充分震荡混合均匀，离心处理去除蛋白，取上清液，氮吹至完全干燥，加入衍生化试剂进行反应。本发明还公开了一种气相色谱-质谱检测尿液甲基丙二酸的方法，其包括本发明的尿液处理方法，并优化了处理后气相色谱和质谱检测的仪器条件。采用本发明的尿液处理和检测方法，大大节省了尿样处理时间，可以简便、快捷、准确地检测有机酸血症，特别是甲基丙二酸血症。
【IPC分类】G01N30/88, G01N30/06
【公开号】CN104991018
【申请号】CN201510363081
【发明人】杨江涛
【申请人】深圳爱湾医学技术服务有限公司
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月26日