萃取
[0047] 3. 1、液液萃取
[0048] 取血液等液体样品1.OmL~2.OmL或肝等组织样品1. 0g~2. 0g剪碎于具塞试管 中。另取3份相同基质的空白样品，1份作为空白样品，另2份添加钩吻素甲和钩吻素子标 准100ng制备成添加样品，混匀。
[0049] 上述样品加一定量的氢氧化钠溶液调pH9~10,加入5. OmL~10.0 mL乙酸乙酯， 振荡10min，高速离心10min。分离有机相后，加有机溶剂进行第二次提取，合并两次有机 相，置于50°C浓缩仪上挥干。残渣用500 yL~1000 yL初始流动相定容，过0.22 ym微孔 有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。
[0050] 3. 2、固相萃取（适用于新鲜血液）
[0051] 按3. 1项制备好样品，加入pH5. 8磷酸盐缓冲液3mL~5mL，充分混旋，超声 15min，8000r/min以上高速离心20min，取上清液待过柱。取3CC HLB固相小柱依次以3mL 甲醇、3mL水活化，将离心后的上清液分别过柱，流速为0. 5mL/min~1. OmL/min ;再以3mL 去离子水和3ml0. 5%甲醇水溶液【本发明中0. 5%甲醇水溶液是指：甲醇水溶液中甲醇的 体积分数为〇. 5%，以下不再赘述】先后淋洗小柱；用2mL甲醇洗脱，收集洗脱液置于50°C快 速浓缩仪上吹干，残渣用500 y L~1000 y L初始流动相定容，过0. 22 y m微孔有机滤膜， 滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。
[0052] 4、仪器检测
[0053] 液相色谱-串联质谱仪条件
[0054] 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：
[0055] 色谱柱：kinetex C18 (3. OmmX 50mm，2. 6 y m 柱或等效色谱柱；
[0056] 流动相及梯度洗脱条件见表1 ;
[0057] 表1流动相和梯度洗脱条件
[0058]
[0059] 进样量：1uL~10uL;
[0060] 扫描方式：正离子扫描（ESI+);
[0061] 检测方式：多反应监测（MRM);
[0062] 电喷雾电压：5500V;
[0063] 离子源温度：650°C ;
[0064] 雾化气压力：55psi ;
[0065] 气帘气压力：50psi ;
[0066] 辅助气压力：50psi ;
[0067] 监测离子对、去簇电压、碰撞能参见表2。
[0068] 表2监测离子对、锥孔电压、碰撞能
[0069]
[0070] 5、记录和计算
[0071] 记录各样品及标准品平行进样2~3次中目标物的保留时间及峰面积值，按公式 (1)计算回收率：
[0072]
[0073] 式中：
[0074] R-回收率；
[0075] A添一添加样品中标准物质的峰面积平均值；
[0076] W纯一标准物质浓度，单位为微克每毫升（yg/mL);
[0077] V添一添加样品的定容体积，单位为毫升（mL);
[0078] A纯一标准物质的峰面积平均值；
[0079] M添一添加样品中标准物质的添加量，单位为微克（yg)。
[0080] 6、定性结果评价
[0081] 6.1、阴性结果评价
[0082] 如果样品未出现与标准品Rt值相同的色谱峰，且添加样品相应目标物的回收率 在60%以上，则阴性结果可靠。
[0083] 如果添加样品中未出现与标准品Rt值相同的色谱峰或回收率低于60%，则阴性 结果不可靠。
[0084] 如果添加样品的添加含量< 0. 02 y g/mL时，可不计算回收率，则阴性结果按以下 方式评价：
[0085] 如果案件样品未出现与标准品Rt值相同的色谱峰，添加样品的色谱峰信噪比大 于10,则阴性结果可靠。
[0086] 如果添加样品中未出现与标准品Rt值相同的色谱峰或添加样品的色谱峰的信噪 比小于等于10,则阴性结果不可靠。
[0087] 6. 2阳性结果评价
[0088] 如果样品中出现与目标物相同的两对定性离子对，其色谱峰保留时间与添加样品 中目标物的色谱峰保留时间比较，相对误差在±2. 5%之内，且所选择的相对离子对丰度比 与添加样品中的相对离子对丰度比之相对误差不超过表3规定的范围，空白样品中未出现 相应的色谱峰，则阳性结果可靠。相关的液相色谱-串联质谱图参见图1~图3。
[0089] 如果空白样品中出现与添加样品中目标物保留时间一致的色谱峰，且定性离子对 及相对丰度一致，则阳性结果不可靠。
[0090] 本发明中钩吻素子、钩吻素甲在血样中的检出限为0. 2ng/mL。
[0091] 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
[0092]
[0093] 实施例2定量分析
[0094] 1、试剂同实施例1
[0095] 2、仪器与材料同实施例1
[0096] 3、样品萃取
[0097] 准确量取案件样品1.OmL~2.OmL或1. 0g~2. 0g平行两份；另取相同基质的空 白样品两份，分别添加相应目标物标准品（添加量应与案件样品粗测量相近）制备成添加 样品，混匀。其他同实施例1。
[0098] 4、仪器检测同实施例1
[0099] 5、记录和计算
[0100] 5. 1、计算药物含量
[0101] 记录各样品平行进样2~3次中目标物峰面积值，按公式（2)计算含量：
[0102]
[0103] 式中：
[0104] W-单位质量样品中目标物质的含量，单位为微克每克（yg/g)或微克每毫升 (y g/mL)；
[0105] A样一样品中目标物的峰面积平均值；
[0106] M添一添加样品中标准物质的添加量，单位为微克（yg);
[0107] V样一样品的定容体积，单位为毫升（mL);
[0108] A添一添加样品中目标物的峰面积平均值；
[0109] M样一样品的取样量，单位为克（g)或毫升（mL);
[0110] V添一添加样品的定容体积，单位为毫升（mL)。
[0111] 5. 2、计算相对相差
[0112] 记录两份平行操作的样品含量，按公式（3)计算相对相差：
[0113]
[0114] 式中：
[0115] RD -相对相差；
[0116] XI、X2 -两份样品平行定量测定的含量数值；
[0117] Z-两份样品平行定量测定含量的平均值。
[0118] 6、定量结果评价
[0119] 如果案件样品中目标物含量的RD > 20%，定量数据不可靠。如果目标物含量的 RD< 20%，定量数据可靠。其含量按两份案件样品的平均值计算。
[0120] 实施例3利用非新鲜血液对本发明的方法进行评价
[0121] 1、试剂，同实施例1。
[0122] 2、仪器和材料，同实施例1。
[0123] 3、样品萃取
[0124] 分别取空白的非新鲜血液1.OmL于具塞试管中；分别添加钩吻素甲和钩吻素子标 准品制备成添加样品，混匀。
[0125] 上述样品中分别加一定量的氢氧化钠溶液调pHIO,加入10.0 mL乙酸乙酯，振荡 lOmin，高速离心10min。分离有机相后，加有机溶剂进行第二次提取，合并两次有机相（对 二次提取后的无机相进行高效液相色谱分析，样品的提取率为98. 1% )，置于50°C浓缩仪 上挥干。残渣用1000 y L初始流动相定容，过0. 22 y m微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串 联质谱仪分析。
[0126] 4、仪器检测
[0127] 液相色谱-串联质谱仪条件
[0128] 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：
[0129] 色谱柱：kinetex C18 (3. OmmX 50mm，2. 6 y m 柱或等效色谱柱；
[0130] 流动相及梯度洗脱条件见表1 ;
[0131] 表1流动相和梯度洗脱条件
[0132]
[0133] 进样量：lyL ~10yL;
[0134] 扫描方式：正离子扫描（ESI+);
[0135] 检测方式：多反应监测（MRM);
[0136] 电喷雾电压：5500V;
[0137] 离子源温度：650°C;
[0138] 雾化气压力：55psi;
[0139] 气帘气压力：50psi;
[0140] 辅助气压力：50psi;
[0141] 监测离子对、去簇电压、碰撞能参见表2。
[0142] 表2监测离子对、锥孔电压、碰撞能
[0143]
[0144] 钩吻素甲添加浓度分别为50ng/m