10 5细胞每只GHRK0小鼠）。在皮下 肿瘤注射之前，所有的小鼠剃毛。通过切诊注射区域测定肿瘤发病率并且在移植后10-15 天开始使用数字Vernier测径器测量肿瘤尺寸。用于C57BL/6和BALB/c的实验在不同的 时间点结束，这基于USC IACUC批准的肿瘤尺寸和溃疡的人道终点标准。GHRK0(C57BL/6背 景）小鼠由 J.J.Kopchick(Ohio University，Athens)慷慨提供。
[0148] 小鼠中的蛋白质限制
[0149] AIN-93G标准食物用作基于酪蛋白的高蛋白质参考膳食（18% kcal来自蛋白质 和低蛋白质膳食1，〇用作基于酪蛋白的低蛋白质膳食（4% kcal来自蛋白质）（Harlan Laboratories，WI)。膳食是等卡路里的并且来自脂肪或碳水化合物的kcal发生的改变与 来自蛋白质的kcal的改变成比例。在开始实验1周前开始日摄取量测量，以便确定基线摄 取量。在实验期间每日饲养所有的动物，并且提供超过它们基线摄取的50%的食物，以便使 得自由的、非卡路里限制的饲养。在肿瘤移植之前，为BALB/c小鼠指定来自蛋白质组2个 不同kcal的一种并且提前饲养1周。在如上述相同地在整个实验期间继续饲养这些小鼠。 为了确定低蛋白质对年老小鼠的作用，24月龄C57BL/6小鼠放置为18 %或4 % kcal来自蛋 白质组并且如上述地进食持续膳食。每日测定体重和摄取。动物随时用水。
[0150] 小鼠中的血清mIGF-I和mIGFBP-1测量
[0151]用3%吸入异氟烷麻醉小鼠，稍微加热以使静脉膨胀，并且从尾静脉收集血液，以 每周获得血清。如先前描述使用内部ELISA试验使用来自R&D系统（Minneap 〇lis，MN)的重 组小鼠IGF-I或IGFBP-1蛋白质和多克隆抗体，进行血清mIGF-I和mIGFBP-1试验（Hwang 等，2008)。
[0152] 用于小鼠数据的统计分析
[0153] 使用Student t检验进行组之间的IGF-I比较，通过Student t检验和AN0VA进 行IGFBP-1组比较，和用双因素AN0VA使用GraphPad Prism v. 6进行肿瘤体积进展组比较。 所有的统计分析是双面的并且〈〇. 05的P值认为是显著的。
[0154] 酵母生存和突变频率测量
[0155] 通过用相应的质粒转化，广泛使用的DBY746酵母菌株的细胞（MATa leu2_3， 112his3-A 1 trpl-289，ura3-52GAL+)为原养型的，接种在lml的完全合成培养基（SDC)上 并且在30°C下在轨道摇床上以200RPM生长过夜。
[0156] 该起始培养物然后分离（1:100)在新鲜合成SDC培养基上，其包含0. 5X、IX或2X 的标氨基酸浓度（Hu等，2013)，以5:1的烧瓶体积与培养基体积比并且以非常相同的条件 放回培养箱。每隔一天收获每个培养物的等分试样并且适当的稀释物平铺在富含YH)的板 上。生长两天之后计数菌落形成单位（C. F. U.)。考虑在第3天的CFU为100%的生存，评 估生存的百分数。所有的实验一式三份进行并且显示标准偏差。对于突变频率计算，在每 个生存时间点收集1〇 7细胞，用水冲洗并且平铺在缺少精氨酸并且补充601iq-l刀豆氨酸 (Can)的合成完全的（SDC)培养基上。在30°C下生长二至三天之后测量Can抗性克隆并且 表达为1〇 6活力CFU中的Can抗性克隆的数量。
[0157] Ras2实验生长条件
[0158]通过每48h测量菌落形成单位（CFU)，在失效的SDC培养基中监测酵母时序寿命。 在第1天CFU的数量视为初始生存（100% )并且用于测定年龄-依赖性死亡率。
[0159] Ras2实验Canl突变频率测量
[0160] 通过测量CAN1 (YEL063)基因的突变频率评估自发突变频率。简言之，在液体SDC 培养基中稀释过夜接种并且在30°C下温育。在第1天开始通过将适当的稀释平铺在酵母 提取物蛋白胨右旋糖（YPD)培养基板上并且计数CFU来每2d测量细胞的活力。为了鉴定 液体培养物中的刀豆氨酸抗性突变体（Car〇,通过离心收获适当数量的细胞（开始量为2x 1〇 7细胞），用无菌水冲洗一次，并且平铺在选择性培养基（补充60 y g/ml 1-硫酸刀豆氨 酸的SDC-Arg)上。3-4d之后计数突变体克隆。突变频率表达为Caf与总活力细胞之比。
[0161] 人低蛋白质摄取研究
[0162] 人受试者参与3轮低蛋白质低卡路里和高营养5天禁食模仿膳食（FMD，以绿色指 示，见正文）随后约3周的正常膳食（棕色指示）（a)。在5天膳食开始和结束时抽血（时间 点A和B)，并且也在完成第3个5天FMD之后的5-8天抽血（时间点C)。5天膳食显著降 低血糖（b)、IGF-1 (c)和 IGFBP-1 (d)水平。葡萄糖 *，p〈0. 05, N = 18 ;IGF-1，**，p〈0. 01， *p〈0. 05，N = 16 ;IGFBP-l，**，p〈0. 01，N = 17 ;所有的统计检验作为配对的t检验进行，在 两个原始值上截尾。该研究的结果见图20。
[0163] 用于化学毒性实验的材料和方法
[0164] 2. 1.小鼠
[0165] 所有的动物方案由南加州大学的动物护理和使用委员会协会（IACUC)批准。在整 个实验中，12-15周龄雌性CD-l、BalB/C或C57BL/6N小鼠（Charles River)保持在无病原 体环境中。
[0166] 2. 2.限定大量营养素的膳食
[0167] AIN93G标准食物（Harlan)用作参考膳食并且如果不另外指出提供给所有的小 鼠。大量营养素组分（脂肪、蛋白质和碳水化合物）改良的膳食都基于AIN93G(图21和表 20)。膳食20% P-1 (大豆油作为脂肪来源）和20% P-2 (椰子油作为脂肪来源）与AIN93G 配方相比来自蛋白质来源的卡路里降低至20% ;0%P膳食不包含蛋白质；所有这些膳食 与AIN93G标准食物是等卡路里的。低碳水化合物LCHP膳食与AIN93G配方相比来自碳水 化合物的卡路里降低至20% (13%对63. 9% )但是包含更多的蛋白质（45. 2% )和脂肪 (41. 8% )。生酮高脂肪膳食60% HF设计为提供60%消耗的卡路里来自脂肪来源，来自蛋 白质和碳水化合物的卡路里成比例下降。90% HF膳食是生酮膳食，其包含90%的脂肪，同 时提供仅仅最小的碳水化合物（小于1% )和一半的蛋白质含量（9% )。详细的膳食组成 和卡路里含量总结在表S2中。在开始实验之前小鼠进食AIN93G对照膳食并且基于它们的 初始体重分成实验组（N = 5/组）。使小鼠适应测试膳食一周然后实验（调整方案显示在 表22中）。除非另外指出，自由供应所有的膳食。
[0168] 2. 3.卡路里限制（CR)和短期饥饿（STS)
[0169] 为了使用AIN93G膳食的卡路里限制，标准食物碾碎成粉末并且以必要的量混 合在水凝胶（清澈（Clear)H 20)中，以实现60%、50%、40%、20%、10%卡路里密度的 AIN93G(表23)。类似地制备限制卡路里的大量营养素改良的膳食（表24)。为了避免营养 不良，所有的膳食补充与AIN93G中那些匹配的维生素、矿物质、纤维和必需脂肪酸。在实验 之前（数据未显示）用AIN93G饲养测定基线食物摄取（3. 7g或14kcal/天）。对于短期饥 饿（STS)方案，小鼠不能进食多达60小时。
[0170] 对于所有的CR和STS实验，小鼠单个关在标准鞋盒笼中，每日清理笼子，以避免食 粪性或进食残留食物。动物随时可饮并且提供水凝胶以确保足够的水合。在CR或STS方 案期间常规测量每个个体动物的体重。
[0171] 2. 4.用于葡萄糖和IGF-1测量的血液收集
[0172] 用2%吸入异氟烷麻醉小鼠并且提供左心室心脏穿刺收集血液。血液收集在 包被用于血清制备（BD)的K 2_EDTA的管中。用Precision Xtra血糖监测系统（Abbott Laboratories)测量血糖。使用小鼠特异性ELIS试剂盒（R&D System)测量IGF-1。
[0173] 2. 5.对高剂量化疗的抗性
[0174] 使称重25-32g的12-15周-龄雌性CD-1小鼠饿多达60h(STS)或进食大量 营养素改良的50 % CR膳食3天，随后静脉内注射24mg/kg多柔比星（DXR，Bedford Laboratories)。在所有实验中，在化学药物注射之后为小鼠提供AIN93G标准食物并且每 日监测。显示严重压力和/或恶化的健康状态的动物指定为垂危的并且安乐死。
[0175] 2. 6.皮下肿瘤模型
[0176] 鼠4T1乳腺癌和GL26神经胶质瘤细胞在37°C 5% C02下保持在补充10%胎牛血 清（FBS)的DMEM(Invitrogen)中。冲洗对数生长期的细胞并且以2xl0 6细胞/mL悬浮在 PBS中以及皮下注射（s.c，100iiLPBS中2xl05细胞/小鼠）小鼠的下背区域。使用测径器 测量肿瘤尺寸。为了模拟人中的多轮处理，用顺钼（Teva parenteral Medicines Inc.)静 脉内（i. v.，侧尾静脉）在分别以12、8和8mg/kg体重肿瘤接种之后第15、33和44天处理 小鼠三次。监测每日小鼠并且显示严重压力、恶化健康状态或过度肿瘤负荷（2000mm)的动 物指定为垂危的并且安乐死。
[0177] 2. 7.统计分析
[0178] 组之间葡萄糖和IGF-1测量的比较用AN0VA进行，随后使用GraphPad Prism v. 5 杜克多重比较。所有的统计分析是两侧的并且〈0. 05的P值认为是显著的。
[0179] 3.结果
[0180] 3. 1.卡路里限制对葡萄糖和IGF-1水平的作用
[0181] 短期饥饿（STS)降低葡萄糖和IGF-1的血清水平，增加细胞对高剂量化学疗法的 保护，并且使恶性的细胞对化疗药物敏感。一旦动物丢失约20%体重，通常实现STS对葡萄 糖和IGF-1的作用。因此，20%体重减轻用作比较限制卡路里的膳食的葡萄糖和IGF-1水 平与从60h STS方案获得的那些的标准。
[0182] 对于90%的CR在第4天，对于80% CR在第6天，对于60%的CR在第9天，或对 于40%的CR在第13天达到20 %体重减轻阈值（图22A和图26A)。实现20 %体重减轻的 时间强烈取决于卡路里限制的严格程度（用r2= 0. 9976的线性拟合；图22B)。在48小 时，血糖水平的下降与卡路里限制的严格程度相关（用r2= 0. 7931的线性拟合；补充图 26B)。相比自由进食小鼠，60h禁食方案（STS)使血糖水平降低70% (图22C，P〈0. 001)。4 天90%的CR方案使血糖下降约40%，显著小于STS (P〈0. 05)。另外，观察到CR降低血糖的 作用取决于CR进食长度的趋势：13天40% CR进食的葡萄糖水平显著（P〈0. 05)小于4天 长90% CR组。但是，没有限制卡路里的组产生的血糖水平小于60h禁食组；并且需要9或 更多天的CR，以在禁食组的那些中获得葡萄糖降低作用（图22C)。所有实验CR组的小鼠， 不依赖于限制的严格程度，当达到20%体重减轻边际时达到类似的血清IGF-1水平并且比 自由对照组中小鼠具有显著（P〈〇. 001)更低的IGF-1水平（图22D)。
[0183] 3. 2.限定大量营养素的膳食对葡萄糖和IGF-1水平的作用
[0184] 基于AIN93G啮齿动物食物设计一组限定大量营养素的膳食（图21和表20)，以确 定具体膳食成分的限制是否可模拟STS或短期CR对血糖和/或血清IGF-1的作用。相比 初始AIN93G配方，低蛋白质膳食20% P-1 (大豆油作为脂肪来源）和20% P-2(椰子油作 为脂肪来源）的来自蛋白质来源的卡路里降低至20%，同时增加碳水化合物和脂肪，以维 持与AIN93G的膳食等卡路里。0% P膳食不包含蛋白质；碳水化合物以及脂肪按比例增加 以保持与标准食物的膳食等卡路里。相比初始AIN93G配方，LCHP膳食来自碳水化合物来源 的卡路里降低至20% (13%对63. 9%)，但是供应更多的蛋白质和脂肪。高脂肪生酮膳食 60 % HF设计为供应60 %的消耗的卡路里来自脂肪来源，来自蛋白质和碳水化合物的卡路 里按比例降低。90 % HF膳食是生酮膳食，其包含90 %的卡路里来自脂肪，而仅仅供应最低 (小于1%)碳水化合物并且9%的卡路里来自蛋白质。由于更高的脂肪比例，相比AIN93G 标准食物，LCHP、60% HF和90% HF膳食具有高卡路里密度。详细的膳食组分和卡路里含 量总结在表21中。
[0185] 雌性⑶-1小鼠自由进食实验膳食连续的九天，以确定体重特征（图23A、B)并且 检测卡路里摄取（图23C、D)。未观察到明显的厌食，但是注意到进食完全缺少蛋白质膳食 (0% P)的小鼠在6天之后降低食物消耗（图23C)。降低的卡路里摄取造成该实验组动物 的体重减轻（图23A)。生酮高脂肪组（60% HF和90% HF)的小鼠在进食的9天期间比进 食AIN93G标准食物的小鼠消耗更多的卡路里（图23D)并且自由进食生酮90% HF膳食小 鼠在4-5天之后快速增重（图23B)。进食膳食20% P和LCHP的实验组中的⑶-1小鼠相 比进食AIN93G对照膳食的小鼠未显示卡路里摄取或体重的差异（图23A、C)。
[0186] 来自大量营养素改良膳食的小鼠在第2天、第5天和第9天的血糖水平与标准食 物膳食的那些没有不同（图27并且数据未显示）。相反，生酮60 % HF膳食9天的小鼠中血 清IGF-1水平明显上升（P〈0. 05)但是进食生酮90% HF膳食的小鼠则没有（图23E)。有 趣地，不仅仅大量营养素组分（例如蛋白质含量）而且脂肪酸来源都不同地调节循环IGF-1 水平：低蛋白质膳食20% P-1 (包含大豆油作为唯一脂肪来源）不降低IGF-1水平但是低 蛋白质膳食20%P-2(椰子油作为唯一脂肪来源）显著（P〈0.05)降低IGF-1水平并且这 些膳食除了脂肪来源没有区别。对血清IGF-1最值得注意的作用是在进食蛋白质不足膳食 〇%P 9天的小鼠。循环IGF-1下降到标准食物的小鼠的约30% (图23E)。蛋白质不足膳 食0% P是唯一的使血清IGF-1水平降低到与60h短期饥饿相当的膳食。
[0187] 3. 3.短期卡路里限制和禁食改善压力抗性
[0188] 在小鼠中，降低的血清IGF-1和血糖水平促进处理高剂量化疗剂诱导的毒性的能 力。因为短期卡路里限制，而不是限定大量营养素的膳食（除了完全的蛋白质去除）降低 IGF-1和葡萄糖水平，组合方法用于测试具有以50%常规每日卡路里摄取进食限定大量营 养素不足的膳食是否可产生增强的化学毒性保护。20% P膳食未包括在压力抗性实验中， 原因是膳食〇% P显示对血清IGF-1更显著的作用。
[0189] 在自由进食AIN93G标准食物或降低至50%正常卡路里摄取的限定大量营养素的 膳食三天的CD-I小鼠中测试压力抗性，然后多柔比星（DXR，24mg/kg，i. v.)处理（图24A)。 在限制50%卡路里的组中，3天之后小鼠减轻它们的初始体重12-15%，而在STS组小鼠中， 在60h之后，它们的体重减轻20%。DXR处理之后，AIN93G食物自由提供给所有的动物并 且小鼠再次增重直到化学毒性诱导体重减轻开始（图28A、B)。体重减轻在所有实验组中 继续直到注射后第8天，其后许多动物缓慢恢复。进食限制卡路里的0% P和LCHP膳食的 小鼠从未完全恢复它们的初始体重（图28A)。注射后9-18天动物开始死于化学毒性（图 24A)，与报道的DXR处理之后骨髓抑制出现和最低天数一致（http://dailymed. nlm. nih. gov)。如果它们DXR注射后25天存活，认为小鼠是幸存者。自由进食AIN93G膳食3天然 后DXR注射的小鼠显示最差的结果，在第25天仅仅16%存活（图24A)。与自由进食的小鼠 相反，大部分（89% )禁食（60小时）小鼠在高剂量化学治疗中存活下来。用DXR处理的对 照小鼠显示中毒症状包括降低的移动性，竖起的毛发和隆起后背姿势，而STS组中的小鼠 在处理之后未显示可见的压力或疼痛的症状（数据未显示）。在DXR注射前三天进食50% CR与大量营养素改良的组合提高了小鼠的压力抗性并且产生45-55%的生存（图24A)。没 有迹象表明脂肪或碳水化合物含量影响结果，因为所有的膳食实现类似的保护程度。数据 指示短期CR，而不是膳食的脂肪或碳水化合物组分，赋予部分化学保护，其不如禁食引起的 那些有力。进食50% CR LCHP膳食的小鼠比所有其他CR进食组表现差，推测因为该膳食的 高蛋白质含量对IGF-1的影响。
[0190] 血糖测量揭示三天进食限制卡路里的改良膳食不足以明显降低葡萄糖水平，50% CR生酮90% HF膳食除外（图24B)。生酮组的葡萄糖水平的降低不呈现增加压力抗性。STS 组中的小鼠具有比所有其他实验组明显更低的血糖水平（图24B)。
[0191] 3. 4.低蛋白质膳食不呈现对GL26神经胶质瘤进展的延迟
[0192] 已经显示低蛋白质膳食降低癌症风险，而高卡路里和高蛋白质膳食与肥胖相关并 且促进调节癌变的激素、代谢和炎症改变。为了测试低蛋白质膳食在神经胶质瘤模型中的 作用，在移植GL26细胞之后，当肿瘤明显时，小鼠从标准食物（18. 8%的卡路里来自蛋白 质，表1)转向低蛋白质的膳食（20% P-l，3.9%的卡路里来自蛋白质）10天（图25A)。进 食低蛋白质膳食的小鼠显示的肿瘤进展无法与自由进食AIN93G膳食的小鼠的区分开（图 25A)。这些结果指示一旦肿瘤形成，肿瘤进展可能不被蛋白质限制延迟。
[0193] 3. 5.短时间段（short-term intermittent)卡路里