在测定叶酸的情形中特别有用的叶酸衍生物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于在体外生物样品中，优选地应用非放射性同位素竞争技术测定叶 酸中特别有用的叶酸衍生物。 现有技术
[0002] 维生素B9是给予都源自叶酸（folic acid)的化学和生物学上非常密切相关的化 合物家族的通用名称。这些化合物的主要特性之一是，它们的以不足量的存在，或它们的实 际的不存在，导致在人或动物中贫血。叶酸家族包括，除其他外，维生素M、维生素Be、叶酸 类似物（folacin)和叶酸。在本申请的意义内，属于该家族的化合物的每个被称为"叶酸 (folate) "，该家族的多个成员被称为"叶酸（folates) "，而维生素B9家族的成分的混合物 被称为"总叶酸"。
[0003] 如本领域技术人员熟知的，叶酸，还称为蝶酰基单谷氨酸（pteroylmonoglutamic acid)，由蝶呤基团、对氨基苯甲酸基团和谷氨酸酯/盐基团形成，如以下由通式（G)所示：
[0006] 其中n是整数1。
[0007] 如该通式中所示，叶酸在其谷氨酸酯/盐部分上具有两个羧酸功能，一个在a位 置，另一个在y位置。
[0008] 在食品中，叶酸主要呈还原的甲基多聚谷氨酸酯/盐或甲酰基多聚谷氨酸酯/盐 的形式。在消化后，这些聚谷氨酸酯/盐转化为单谷氨酸酯/盐（monoglutamates)，被肠细 胞主动地吸收。然后，单谷氨酸酯/盐转化为5-甲基四氢叶酸（5-MTHF)，叶酸以这种形式 穿过肠屏障并进入全身循环。
[0009] 在血液中，循环叶酸的主要部分以弱亲和力结合各种蛋白：a 2巨球蛋白（40% )、 白蛋白（33% )和转铁蛋白（23% )。维生素B9的血浆浓度从5 y g/L至15 y g/L变化，并 很大程度上受食物摄取的影响。维生素B9浓度在红细胞中高约20倍，其可包含高达95% 的循环叶酸。叶酸的多种形式存在于人血清中，但占优势的循环和细胞内的形式是5-甲基 四氢叶酸（5-MTHF)，其还呈肝存储的形式。通常，生物活性化合物单独呈还原形式：二氢叶 酸（DHF)和主要四氢叶酸（THF)，以及其甲基或甲酰基衍生物。如上所述，在本申请的意义 内，名称"叶酸"包括特别是这些还原形式；分别地取的所述的形式的每个，被称为"叶酸"。
[0010] 真核细胞，以及某些原核细胞，不能合成叶酸。因此，它们使用允许内化外源分子 的跨膜运输系统。目前，已描述了两种主要的运输系统。然而，很可能还存在次要途径，诸 如被动扩散。氧化叶酸如叶酸由叶酸受体（FR)在细胞内运输，"叶酸受体"在英语语言中 (Antony，1992[l])。这些蛋白以前被称为"叶酸结合蛋白"（FBP)。在人类中已鉴定了三种 亚型，分别称为FRa (P15328)、FR0 (P14207)和FRy (P41439)，括号之间所示的代码对应 于该蛋白在UniProt数据库中的标识符（http://www. uniprot. org)。FRa和0由脂质部 分，糖基磷脂酰肌醇（GPI)锚定在质膜中。y亚型是分泌的。另一方面，还原的叶酸，由英 语中称为还原的叶酸载体（P41440)或"还原叶酸载体"（RFC)的蛋白来运输。这是高度糖 基化的整合膜蛋白，其具有多个跨膜域。
[0011] 由于它们的化学结构，叶酸在我们的有机体的基本成分即氨基酸和碱基（嘌呤和 嘧啶）的合成及代谢中发挥重要作用。
[0012] THF，重要的辅酶，能够固定并转移自由基至碳原子。它参与甘氨酸的合成及组氨 酸的分解代谢。
[0013] 5-MTHF允许通过甲基钴胺素和甲硫氨酸合成酶将高半胱氨酸再次甲基化为甲硫 氨酸。叶酸还参与嘌呤和嘧啶的生物合成的几个关键步骤，从而影响核酸DNA和RNA的合 成。由于这种核心作用，叶酸缺乏具有严重的后果和许多生理病理表现。
[0014] 严重叶酸缺乏通常引起血液学和神经精神病学迹象。慢慢地，出现乏力和厌食。贫 血可以以单独的大红细胞症为先导。通常是巨幼红细胞类型的这种贫血，是叶酸缺乏的最 常见的表现之一。此外，通常还存在叶酸和铁的组合的缺乏，其导致伴随涂片上Jolly小体 的存在的正常红细胞贫血，而不是经典大红细胞贫血。该贫血是由于这样的事实：嘌呤和嘧 啶不以足够的量供应，从而导致血液干细胞合成遗传物质并因此分开的不可能性。相反，现 有的细胞继续生长，其通常部分解释了与叶酸缺乏相关的贫血的巨幼红细胞类型。
[0015] 叶酸还对大脑的正常运作是必要的，并有助于心理健康和情绪平衡。因此，维生素 B9缺乏导致神经精神病学问题。这些问题可部分地与某些胺和甘氨酸的合成中的异常现象 有关。后者还是神经递质。
[0016]由于其对遗传物质的合成的贡献，叶酸的令人满意的摄入在童年时期、青 春期和妊娠期间是特别必要的。事实上，精神运动性阻滞和身长-重量发育不良 (staturo-ponderal hypotrophy)经常发现于具有叶酸缺乏的儿童中。在妊娠期间，叶酸缺 乏可引起在胎儿发育的延迟或异常，或甚至先天性畸形诸如是神经管的不完全闭合的脊柱 裂，或甚至三体型。
[0017] 叶酸缺乏还与心血管疾病，更确切地动脉和/或静脉形成血栓和动脉硬化 (atheroscleroses)的风险增加相关。该风险与血衆高半胱氨酸水平的增加相关，起因于缺 乏该化合物变为甲硫氨酸的甲基化。
[0018] 这个列表不是限制性的，且叶酸缺乏可引起其他紊乱/病理学。因此首要的是能 测定人或动物个体中全部或部分叶酸，优选地"总"叶酸，即由不同叶酸形式的混合物形成 的。
[0019] 此外，还重要的是能够定量食物来源（意在人或动物摄取）的样品中存在的全部 或部分叶酸，以证实讨论中的食物的维生素B9的贡献。测定食品类产品中的叶酸还可证明 是有利的，以便确保这些包含叶酸的足够的量/浓度。此类食物补充剂可特别用于预防可 能的维生素B9缺乏。
[0020] 测定全血、血清、血浆或红血细胞中的叶酸，从临床观点来看具有一定的优势。血 液叶酸浓度的减少可能导致表示应该临床研究可能与其他维生素或代谢物测定相关的缺 乏。血液叶酸水平受取决于饮食或药物的服用的变化支配。红血细胞的叶酸水平给出生物 体的叶酸储备的最佳估计值。
[0021] 存在几种方法，以允许定量临床来源，即来自患者的生物样品中的血浆、血清和/ 或红细胞叶酸。这些方法可分类为三个主要的组，即：（1)微生物学技术、（2)色谱技术、及 (3)竞争免疫测定。
[0022] 微生物学技术（1)通常使用"叶酸依赖性"种子，其的生长与待测定的样品中存在 的维生素水平成比例。通常，将样品在作为抗氧化剂的维生素C的存在下在KKTC脱蛋白。 与细菌菌株的接触在37°C下进行20小时。最常用的种子细菌，干酪乳杆菌（Lactobacillus casei)，对叶酸的所有氧化和还原的形式敏感；其他种子对更特定的形式敏感。例如，奠链 球菌（Streptococcus faecalis)允许除了 5-MTHF以外的所有形式的叶酸的测定。在血清 和红血细胞中的优势形式的5-MTHF的浓度，由干酪乳杆菌和粪链球菌的值之间的差异来 获得。第三种子，啤酒片球菌（Pediococcus cerevisiae)，仅对N5-甲酰基-THF (亚叶酸） 敏感。
[0023] 虽然通常这些微生物技术（1)敏感并可再现，但冗长并耗时。此外，它们存在干扰 抗生素和抗有丝分裂剂，诸如甲氨蝶呤、甲氧苄啶和乙胺嘧啶的风险。
[0024] 色谱类型⑵的测定允许分离属于叶酸家族的不同的化合物。作为色谱测定的实 例，可特别列举：
[0025] -与HPLC结合的薄层色谱测定（Reif，V. D.等人，1977 [2])，
[0026] _与质谱分析法（MS)结合的色谱测定（通常气相或液相），例如：
[0027] a)带有同位素稀释的气相色谱/质谱分析法（ID-GCMS) (Dueker，S. R等人 2000 [3])，或
[0028] b)与同位素稀释串联的液相色谱/质谱分析法（ID-LC-MS/MS) (Pfeiffer，C. M.等 人，2004 [4])。
[0029] 色谱类型（2)的这些测定显著地具有需要开发完全技术测试，需要合格人员的缺 点。此外，证明仪器是昂贵的。
[0030] 考虑到实施微生物（1)和色谱（2)技术遇到的问题（参见上文），已开发了竞争免 疫测定（3)。尽管减少分析时间，这些后者（3)允许"总"叶酸的测定，并因此，提供涉及可 能的叶酸缺乏的可靠的临床诊断。
[0031]这些免疫测定方法（3)，还称为免疫测定或免疫化学测试，包括，将待检测的分析 物（在这种情况下是叶酸）与是该分析物的结合配对物（binding partner)的至少第一化 合物结合。当叶酸测定通过竞争实现时，方法还包括参加与待测定、有关固定在结合配对物 上的叶酸竞争的至少第二化合物，该第二化合物是叶酸衍生物。该反应的监测包括标记两 种化合物中的一个。该标记的化合物称为标记的缀合物或示踪物。
[0032] 当然，前缀"免疫"，例如在"免疫测定"中，在本申请中不被认为是严格指示，结 合配对物是免疫学配对物，诸如抗体或抗体片段。事实上，如本领域技术人员熟知的，该术 语更广泛地用于指定测试和方法，其中结合配对物，还称为配体，不是免疫配对物，但由，例 如，需要待测定的分析物的受体组成。条件是结合配对物能够优选地以特异性方式结合 分析物。因此，已知，使用术语ELISA(酶联免疫吸附测定）用于使用严格意义上的非免 疫结合配对物的测定，在英语中更广泛称为"配体结合测定"，其可翻译成法语为"Dosage utilisant la liaison di un ligand"，而术语"免疫"包括在首字母缩略词ELISA中。为 了清楚和一致起见，在本申请中使用术语"免疫"以指定使用合适的结合配对物优选地以特 异性方式结合待定量的分析物的任何测定，甚至当该结合配对物不是最严格意义上的免疫 学性质或来源时。
[0033] 在竞争免疫测定（3)的情形下，并且当使用标记的缀合物时，取决于标记的缀合 物的性质及由所述缀合物发射的信号的类型区分三种类型的竞争免疫测定，即：
[0034] -放射性同位素免疫分析（Waxman S?和Schreiber C.，1980 [5])，
[0035] -免疫酶测定法或EIA "酶联免疫-测定";取决于选择的酶底物，信号可呈荧光的 比色类型（Hansen, S. I.和Holm J.，1988 [6])或化学发光类型，
[0036] -电化学发光免疫测定（Owen,W. E?和RobertsW. L. 2003 [7])。
[0037] 竞争免疫测定的后两种类型称为"非放射性同位素竞争免疫测定"。
[0038] 放射性同位素方法（RIA)的发展，从20世纪60年代，使维生素且特别是维生素B9 的定量彻底改变。
[0039] 专利申请W0 80/00562通过公开由谷氨酸酯/盐衍生物取代在a碳和/或y碳 携带的羧酸官能团的放射性叶酸衍生物阐明了这一点。放射性标记来自碘-125或130在 酪氨酸结构的苯酚环中的插入。
[0040] 法国专利申请FR-A-2455602还涉及获得放射性碘化的化合物，并提到通式的蝶 酸衍生物：
[0041]
[0042] 其中谷氨酸酯/盐基团被基团X代替，该基团X表示，当需要时，必定包含对于放 射性同位素标记（用碘125、131或123)不可缺少的芳香环或杂环的氨基酸或"脱-羧基氨 基酸"的残基。该碘化的芳香环或杂环通过不包含多于5个碳原子的链从对氨基苯甲酸基 团分离，所述链由仲胺附着于对氨基苯甲酸基团。作为包含芳香环或杂环的"脱-羧基氨基 酸残基"，公开了以下结构：
[0043]
[0044] 然而，这些放射性同位素测定（RIA)，特别具有放射性废物处理和标记的试剂的半 衰期相对短的持续时间的缺点。
[0045] 这是已开发对如今仅很少使用的RIA不利的非放射性同位素竞争免疫测定的原 因。
[0046] 以实例说明，出版物Arcot J.等人，2005[8]描述了用于通过结合于以酶加标签 的蛋白测定叶