预防化学毒性和与年龄相关的疾病的方法和膳食的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年2月12日提交的美国临时申请系列号61/763, 797的权益，其 内容通过引用以其整体并入本文。
[0003] 关于联邦资助的研究和开发的声明
[0004] 本发明在根据美国国立卫生研究院授权的合同号P01 AG034906-01的政府资助下 完成。政府享有本发明的某些权利。
技术领域
[0005] 在至少一个方面中，本发明涉及减轻与年龄相关的疾病和化学毒性的症状的方 法。
【背景技术】
[0006] 没有营养不良的卡路里限制（Caloric restriction, CR)已经一贯显示延长许多 动物模型的寿命，包括酵母、秀丽隐杆线虫和小鼠。但是，CR对非人灵长类的寿命仍有争议， 并且可受膳食成分的严重影响。认为模型生物体中与CR相关的寿命延长通过其对GH、GHR 的作用而发挥作用，导致随后IGF-1和胰岛素水平和信号传导的不足。在秀丽隐杆线虫中， 通过显示胰岛素/IGF-1途径中的通过营养素可用性调节的突变造成寿命的两倍增加，发 现了该途径对寿命的影响。其他研究揭示了功能在于生长信号传导途径，包括T 〇r-S6K和 Ras-cAMP-PKA的基因的直向同源基因的突变，促进多个模型生物体中的衰老，因此提供了 通过促生长营养素信号传导基因保守调节衰老的证据。
[0007] 最近，已经显示患生长激素受体缺乏（GHRD)的人，展示血清IGF-1和胰岛素水平 的重大缺陷，表现出无癌症死亡率，没有糖尿病，并且尽管具有更高的肥胖发病率，结合该 组中来自心脏疾病和中风的死亡与它们亲属的那些类似。在调查了 230例GHRD的研究中， 也报道了类似的癌症的预防。
[0008] 蛋白质限制或具体氨基酸，比如甲硫氨酸和色氨酸的限制，可阐释卡路里限制 (calorie restriction)对寿命和疾病风险的部分影响，因为蛋白质限制降低了 IGF-1水 平，可延长哺乳动物的寿命，与卡路里摄取无关，并且也已经显示降低啮齿动物模型中的癌 症发病率。
[0009] 因此，需要膳食干预，其可在愿意慢慢修改他们的膳食和仅仅考虑定期干预而继 续他们正常膳食的两种受试者中减轻与年龄相关的疾病的症状。
【发明内容】
[0010] 本发明通过提供至少一个实施方式解决了现有技术的一个或多个问题，提供了减 轻衰老的症状或与年龄相关的症状的方法。该方法包括其中测定受试者的平均日蛋白质摄 取水平的步骤。在一个改良中，平均日蛋白质摄取水平表达为来自受试者平均每天消耗的 蛋白质的卡路里百分数。就蛋白质消耗而言，测定来自动物和植物来源的蛋白质卡路里的 相对量。如果受试者的平均日蛋白质摄取水平鉴定为大于预定的临界（cutoff)蛋白质摄 取水平和如果受试者比预定的年龄更小，为受试者提供定期的低蛋白质高营养膳食代替他 们的正常膳食。
[0011] 在另一方面中，提供了用于降低受试者中葡萄糖和/或IGF-1水平的方法。方法 包括为受试者提供定期低卡路里和/或低蛋白质膳食的步骤，其中小于约10%的卡路里来 自植物基蛋白来源。监测受试者的葡萄糖和/或IGF-1水平，以确定是否应增加或降低蛋 白质摄取。
[0012] 在另一方面中，低蛋白质膳食包括补充剂，其提供额外水平的非必需氨基酸，与非 常低蛋白质量或没有蛋白质的膳食一起在5至7天的时间内被消耗。在一个改良中，低蛋 白质膳食与正常的蛋白质膳食交替。在这样的变型中，每2周至2月提供低蛋白质植物基 膳食7天，期间是1至7周的正常膳食。典型地，补充剂提供一个或多个下述氨基酸作为氮 源：丙氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸同时基 本上不包括异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸和精氨 酸，以使得异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸和精氨 酸的组合以小于受试者的膳食的总重5%的量存在。在进一步改良中，异亮氨酸、亮氨酸、赖 氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸和精氨酸的组合以小于受试者的膳食的 总重的3%存在。
【附图说明】
[0013] 图1.表9显示适合人受试者的禁食模仿膳食的卡路里概述。禁食模仿膳食 (fasting mimicking diet，FMD)，Prolon，在诱导禁食样应答的同时使营养最大化。显示 了 5天膳食每天消耗的卡路里，以及每镑和千克的体重调整的kcal。5天膳食方案期间消 耗的卡路里的减少（A 5天）显示为1)基于每天膳食2, 000卡路里，或2)基于分别对于个 人体重多200、150-200和< 150镑的2, 800、2, 400和2, 000卡路里膳食；
[0014] 图2.表10显示对于适合180-200镑的人受试者的每膳食天的限定的大量营养素 含量。基于平均180-200镑的人用于5天FMD方案每天的大量营养素含量。在第1天膳食 的卡路里摄取相比接下来的天（2-5)稍微下降，使得人体适应低卡路里消耗。呈现了由脂 肪、碳水化合物（具体由糖）和蛋白质为Prolon方案的每天贡献的卡路里％ ;
[0015] 图3.表11显示在本发明的变型中对于适合180-200镑的人受试者的每一膳食天 限定的微量营养素含量。基于平均180-200镑的人的5天FMD方案每天的微量营养素含量。 基于2, 000卡路里膳食计算每日值的百分数（％ DV)。*对于一些微量营养素，DV未限定； 显示的值基于参考日摄取量（RDI);
[0016] 图4.使用Cox比例风险模型，对于全因和癌症死亡率，发现了年龄和蛋白质组之 间的统计学上显著的（P〈. 05)相互作用。基于这些模型，通过在基线的年龄为每个蛋白质 组计算预测的剩余的预期寿命。基于结果，在66岁之前低蛋白质呈现具有针对全因和癌症 死亡率的保护作用，在66岁的点其变成有害的。对于心血管疾病（CVD)和糖尿病死亡率没 有发现显著的相互作用；
[0017] 图5. 50-65和66+受访者中血清IGF-1水平报告低、中或高蛋白质摄取。具有低 蛋白质摄取的那些50-65受访者中IGF-1当与高蛋白质摄取相比时明显更低（P = 0. 004)。 在66+年龄，高和低摄取之间的区别变得边缘显著（P = 0. 101)。计算IGF-1水平的群组包 括2253名受试者。50-65岁的那些（n = 1，125)中，89名在低蛋白质组别，854名在中蛋 白质组别，和182名在高蛋白质组别。66+年龄的那些（n = 1，128)中，80名在低蛋白质组 别，867名在中蛋白质组别，和181名在高蛋白质组别。*P〈0. 01 ;
[0018] 图6. (A)移植20, 000黑素瘤（B16)细胞，和进食高蛋白质（n= 10)或低蛋白质（n =10)膳食的18周龄雄性C57BL/6小鼠中的肿瘤发病率。⑶进食高蛋白质（n = 10)或 低蛋白质（n = 10)膳食的（18wk)C57BL/6雄性小鼠中的B16肿瘤体积进展。（C)在16天， 进食高蛋白质（n = 5)或低蛋白质（n = 5)膳食的（18wk)雄性C57BL/6小鼠中的IGF-1。 (D)在16天，进食高蛋白质（n = 10)或低蛋白质（n = 10)膳食的雄性（18wk)C57BL/6小 鼠中的IGFBP-1。（E) 10月龄雌性GHRK0小鼠（n = 5)对年龄一致的同窝仔畜对照（Ctrl ; n = 7)的B16黑素瘤肿瘤进展。（F)移植20, 000细胞乳腺癌（4T1)，进食高蛋白质（n = 10)或低蛋白质（7% ;n = 10)膳食的12周龄雌性BALB/c小鼠的肿瘤发病率。（G)进食 高蛋白质（n = 10)或低蛋白质（n = 10)膳食的雌性（12wk)BALB/c小鼠中的4T1乳腺癌 进展。（H)在16天，进食高酪蛋白蛋白质（n = 5)或低酪蛋白蛋白质（n = 5)膳食的雌性 (12wk)BALB/c小鼠中的IGF-1。（I)在16天，进食高酪蛋白蛋白质（n = 10)或低酪蛋白蛋 白质（n = 10)膳食的雌性（12wk)BALB/c小鼠中的IGFBP-1。（J)在16天，进食高大豆蛋 白质（n = 5)或低大豆蛋白质（n = 5)膳食的雌性（12wk)BALB/c小鼠中的IGF-1。（K)在 16天，进食高大豆蛋白质（n = 10)或低大豆蛋白质（n = 10)膳食的雌性（12wk)BALB/c小 鼠中的IGFBP-1。暴露于0. 5x、lx或2x浓度的标准氨基酸混合物的酵母的（L)生存和（M) DNA突变频率。（N)在仅仅包含Trp、Leu和His的培养基中生长的酵母相比在存在全氨基 酸的情况下生长的那些中的PDS和STRE活性。（0)Ras2缺失避免慢性暴露于ImM H202的 野生型（DBY746)和ras2 A突变体中测量为DNA突变频率（Can1)的氧化应激-诱导的基 因组不稳定。（P)酿酒酵母（S.cerevisiae)中氨基酸对于衰老和基因组不稳定影响的模 型。氨基酸激活也被葡萄糖激活的Tor-Sch9和Ras-cAMP-PKA途径，并且部分通过降低的 Gisl和Msn2/4活性来促进年龄和氧化应激-依赖性基因组不稳定。*P〈0. 05, **P〈0. 01， _P〈0. 001，*_P〈0. 0001 ;
[0019] 图7.蛋白质摄取对年幼和年老小鼠体重的影响。（A)进食高（18% )蛋白质膳食 的年幼（18周龄）（n = 10)和年老（24月龄）（n = 6)C57BL/6小鼠。⑶进食低（4% )蛋 白质膳食的年幼（18周龄）（n = 10)和年老（24月龄）（n = 6) C57BL/6小鼠；
[0020] 图8.表12 :死亡率和蛋白质摄取之间的相关性；
[0021] 图9. (A)进食等卡路里但是不同的高（18% )或低（4% )蛋白质含量膳食的18 周龄雄性C57BL/6小鼠的30天体重。（B)进食等卡路里但是不同的高（18% )或低（4% ) 蛋白质含量膳食的18周龄雄性C57BL/6小鼠的30天食物摄取，以kcal/天计。（C)在16 天，进食高蛋白质（n = 10)或低蛋白质（n = 10)膳食的雄性（18wk)C57BL/6小鼠中的 IGFBP-2。（D)在16天，进食高蛋白质（n = 10)或低蛋白质（n = 10)膳食的雄性（18wk) C57BL/6小鼠中的IGFBP-3。（E)进食等卡路里但是不同的高（18% >)或低（7% >)蛋白质 含量膳食的12周龄雌性BALB/c小鼠的30天体重。（F) 12周龄雌性BALB/c小鼠进食等卡 路里但是不同的高（18% )或低（4% )蛋白质含量膳食的30天食物摄取，以kcal/天计。 (G)在16天，进食高蛋白质（n = 10)或低蛋白质（n = 10)膳食的12周龄雌性BALB/c小 鼠中的 IGFBP-3。*P〈0. 05, **P〈0. 01，***P〈0. 001，****P〈0. 0001 ;ANOVA ;
[0022] 图10. 10月龄雌性GHRKO小鼠（n = 5)对年龄一致的野生型对照（Wt ;n = 13)中 的B16黑素瘤的肿瘤体积进展。**P〈0. 01 ;
[0023] 图11. (A)酵母时序生存和⑶减弱的年龄-依赖性基因组不稳定显示为相比 ras2A突变体野生型（DBY746)中CAN1基因（测量为Can 1突变体/10 6细胞）的突变频率。 (C)用ImM H202慢性处理的野生型和ras2A突变体的时序生存。⑶Ras2的缺乏避免氧化 应激-诱导基因组不稳定（突变频率Can〇。*P〈0. 05, #P〈0. 01，##P〈0. 0001 ;
[0024] ]图12a)_f). IGF-1减轻蛋白质消耗和死亡率之间的相关性。基于来自蛋白质 和对死亡率的IGF-1之间的相互作用的Cox比例风险模型的结果，通过中和高蛋白质组的 IGF-1计算相对于低蛋白质组的预测的风险比。在50-65岁年龄组中，对于全因（3a)或CVD 死亡率（3b)没有发现蛋白质和IGF-1之间显著的相互作用。但是，对于50-65岁受试者， 对于癌症死亡率（3c) IGF-1和高对低蛋白质之间的相互作用是显著的（p = . 026)。结果显 示对于IGF-1每10ng/ml的增加，高蛋白质组相对于低蛋白质组，癌症死亡率风险增加9% (服高蛋自& IGF1:l.〇9 ;95% Cl :1.01-1. 17)。对于66+年龄的受访者仅仅对于CVD死亡率， 蛋白质和IGF-1之间的相互作用明显。如果IGF-1也低，具有高或中蛋白质膳食的那些具 有降低的CVD风险；但是，随着IGF-1增加没有好处；
[0025] 图13.表13 :样品特征；
[0026] 图14.表14 :蛋白质摄取和死亡率之间的相关性（N = 6, 381);
[0027] 图15.表15 :IGF_1对死亡率和蛋白质摄取之间的相关性（N = 2, 253)的影响；
[0028] 图16.表16 :蛋白质和IGF-I对死亡率之间的相互作用的风险比；
[0029] 图17.表17 :动物和植物蛋白质对死亡率和蛋白质摄取之间的相关性的影响；
[0030] 图18.表18 :通过年龄和蛋白质摄取调整的平均HbAlc、糖尿病患病率和平均 BMI ；
[0031] 图19.表19 :没有糖尿病的参与者中在基线时糖尿病死亡率和蛋白质摄取之间的 相关性；
[0032] 图20A-D.人受试者参与3轮低蛋白质低卡路里和高营养5天禁食模仿膳食（FMD， 以绿色指示，见正文）随后约3周的正常膳食（棕色指示）（A)。在5天膳食之前和结束时 (时间点A和B)，而且也在完成第3个5天FMD之后5-8天（时间点C)抽血。5天膳食 显著降低血糖⑶、IGF-1 (c)和 IGFBP-1 (D)水平。葡萄糖 *，p〈0. 05, N = 18 ;IGF-1，**， p〈0. 01，*p〈0. 05, N = 16 ;IGFBP-1，**，p〈0. 01，N = 17 ;所有的统计测试作为配对的 t 测 试进行，两个在原始值上截尾；
[0033] 图21.由实验膳食的大量营养素提供的卡路里，以％计。AIN93G标准食物是参考 膳食并且提供给所有的小鼠。在大量营养素组分（脂肪，蛋白质和碳水化合物）中改良的 实验膳食都基于该膳食。低碳水化合物LCHP膳食与AIN93G配方（13%对63. 9% )相比，来 自碳水化合物的卡路里降低至20%，但是包含更多的蛋白质（45.2% )和脂肪（41.8% )。 膳食20% P-1 (大豆油作为脂肪来源）和20% P-2(椰子油作为脂肪来源）的来自蛋白质 来源的卡路里降低至20%与AIN93G配方相比；0% P膳食不包含蛋白质；所有这些膳食与 AIN93G标准食物是等卡路里的。设计生酮高脂肪膳食60% HF，以提供60%来自脂肪来源 的消耗的卡路里，按比例降低来自蛋白质和碳水化合物的卡路里。90% HF膳食是包含90% 脂肪同时仅仅提供最小碳水化合物（小于1% )和一半蛋白质含量（9% )的生酮膳食。详 细的膳食组成和卡路里含量总结在表14中；
[0034] 图22.卡路里限制降低体重、葡萄糖和IGF-1。A)雌性⑶-I小鼠，12-15周龄自由 进食（灰色正方形）AIN93G啮齿动物标准食物，暴露于40 %、60 %、80 %和90 %的限制卡路 里的AIN93G膳食（三角形）或禁食（STS，绿色矩形），直到小鼠丢失20%它们的初始体重 (点划线）。每个实验组N = 5。所有的数据表示为平均数土SEM。B)线性拟合CR方案的 严重程度对持续时间（天），直到达到80%的体重。C)当达到80%体重时的小鼠的血糖水 平。红线表示平均数；*p〈〇. 05，***p〈0. 001，AN0VA，杜克多重比较。D)当达到80%的体重 时，小鼠的血清IGF-1水平。红线表示平均数；***p〈0. 001，AN0VA，杜克多重比较；
[0035] 图23.限定大量营养素的膳食对体重、食物摄取、葡萄糖和血清IGF-1的作用。五 只雌性12-15周龄的CD-I小鼠自由进食AIN93G啮齿动物标准食物（黑圆圈）或A)两个 不同低蛋白质膳食（20% P-1和20% P-2)，低碳水化合物但是高蛋白质（LCHP)的膳食，缺 乏蛋白质的膳食（〇% P)或B)高脂肪膳食（60% HF)和生酮膳食（90% HF)。关于大量营 养素的详细概述显示在表1中。C)每日自由卡路里摄取膳食AIN93G、20% P-l、20% P-2、 LCHP和0%P。D)每日自由卡路里摄取膳食60%HF和90%HF;AIN93G显示为参考。所 有的数据表示为平均数土SEM。E)自由进食9天之后的血清IGF-1水平。线表示平均数； *p〈0. 05, *#p〈0. 001，AN0VA，与AIN93G对照相比的杜克多重比较；
[0036] 图24. A)对于限制卡路里的限定大量营养素的膳食的压力抗性测试。小鼠自由进 食（AIN93G)、禁食60h(STS)或进食具有限定的大量营养素组分的限制50%卡路里的膳食 (AIN93G、LCHP、0%P、60%HF、90%HF)3天（绿色盒）然后静脉内注射多柔比星（24mg/kg， 红色虚线）。注射后跟踪生存25天，其后认为剩余的动物是幸存者。B)3天自由进食和CR 膳食之后，以及60h STS之后的血糖水平。线表示平均数。*p〈0. 05，*#p〈0. 001，AN0VA， 杜克多重比较。用统计软件Prism(GraphPad Software)绘制来自配对汇集实验的生存数 据；
[0037] 图25.体内GL26神经胶质瘤和4T1乳腺癌的肿瘤进展。A)通过以mm3计总的肿 瘤体积显示鼠GL26神经胶质瘤的皮下肿瘤进展。当在第10天肿瘤在皮下明显时，开始肿 瘤测量。动物自由进食AIN93G(N = 5)作为对照或低蛋白质膳食20% P-1 (N = 6)。所有 的数据表示为平均数土SEM。B)通过以mm3计总的肿瘤体积显示鼠4T1乳腺癌的皮下肿瘤 进展。当在第12天肿瘤在皮下明显