用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株的制作方法
【专利说明】
[0001] 母案申请
[0002] 本专利申请案要求于2012年12月12日提交的法国专利申请第FR 12 61916号 的优先权。该法国专利申请案的全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及用于治疗及/或预防腹泻的益生菌菌株，尤其是芽孢杆菌（Bacillus) 的益生菌菌株的领域。本发明还涉及选择具有作用于结肠中水分吸收的特定性质的益生菌 菌株的方法。
【背景技术】
[0004] 当正常运作时，人体结肠吸收约99%的进入其内腔的水分，这代表每天约2升水。 结肠具有吸收额外的多达4水的能力。然而，每天超过6升水时，其吸收能力达到饱和而发 生腹泻。
[0005] 腹泻是常见的问题（全球每年约20亿个病例），其特征为较平常大量且频繁（每 天排便多于3次）的水状或软性大便。在极端情况下，每天可损失超过20升的液体。
[0006] 腹泻不是疾病，而是一种症状。其最常见的原因是摄入受污染的水或食物；在这 种情况下，其持续一或两天，而无需治疗。然而，腹泻本身可引起可能致命的脱水，尤其是 在婴儿中，当体重减少超过10%时需送院急诊。根据世界卫生组织，腹泻是第三世界国家 中婴儿致死原因中第二常见的，且5岁以下儿童的死亡病例中有18%是由其造成。（Bryce 等，Lancet, 2005, 365:1147-1152) 〇
[0007] 由腹泻引起的脱水是在损失的液体未被补偿时发生。在正常情况下，水分是在结 肠中从粪便里去除。包含在摄入物中的水分被再吸收的现象是在结肠细胞水平通过水分和 电解质的主动和被动运输的组合发生。在结肠上皮的内陷隐窝的水平上，水分从血液分泌 到外部环境中。在健康良好的人体中，这两种现象彼此互补，因而能保持大便适度含水，从 而促进肠道转运并改善分子循环的条件。
[0008] 腹泻有许多可能的原因，包括由病毒、细菌或寄生性病原体引起的传染源性的腹 泻及非传染性腹泻，例如由食物不耐性、脂肪饮食、酒精、心理因素、施用医药产品、施用治 疗程序引起的腹泻、与疾病或临床病况相关的腹泻、或与停药相关的腹泻。
[0009] 根据症状的持续时间可区分急性腹泻和慢性腹泻，其症状分别持续不到两周及至 少两周。
[0010] 用于治疗腹泻的典型药物为，例如洛哌丁胺（loperamide)，其通过刺激水分和电 解质吸收，及减缓运输时间来起作用。然而，减缓运输时间在沙门氏菌（Salmonella)、志贺 氏菌（Shigella)或艰难梭状芽孢杆菌（Clostridium difficile)型的严重传染中可能会 产生问题，因为该病原菌长时间保留在肠道内。
[0011] 益生菌提供治疗和/或预防腹泻的引人关注的替换选择。最常用于此适应症的益 生菌是乳酸菌。因此，益生菌通常被描述为对免疫系统和肠道菌群平衡具有有益作用。
[0012] 其他研究试图鉴定用于治疗或预防腹泻的新靶标。因此，文件WO2004/028480描 述了通过CFTR蛋白（囊性纤维化跨膜转导调节因子）降低氯离子转运效率的噻唑烷酮型 化合物及其于治疗分泌型腹泻的用途。Bradford等（Am. J. Physiol. Gastrointes. Liver Physiol.，2009, 296 :G886_G898)检验了用于治疗罹患囊肿性纤维化（mucoviscidosis)的 患者（其中CFTR的表达被改变）的肠阻塞及脱水的方法。
[0013] 此外，据描述，在患有囊肿性纤维化的小鼠中部分或完全丧失NHE3蛋白（钠氢交 换体3)降低了肠阻塞的发病率，特别是通过增加肠道流动性，因而总结出NHE3是调节罹患 囊肿性纤维化且其CFTR表达被改变的患者的肠道流动性的潜在靶标。
[0014] 因此，仍需要用于治疗和/或预防腹泻的新策略。
[0015] 发明简沐
[0016] 总体上，本发明是基于某些益生菌菌株能够以完全新颖的方式通过诱导吸收结肠 中存在的过量水分而直接作用于腹泻这一发现。令人惊讶且出乎意料的是，本发明人表明， 某些益生菌菌株能够抑制涉及结肠中水分分泌的转运体（transporter)的表达和/或刺激 涉及结肠中水分吸收的转运体的表达，因而可用于治疗和/或预防腹泻。
[0017] 因此，这些益生菌菌株以相当新颖的方式不作为转运体的抑制剂（即，不通过结 合转运体来起作用）来阻碍其功能，而是作用于转运体的表达，从而作用于转运体的存在 数量。
[0018] 再者，由于这些益生菌菌株是直接作用于结肠中存在的过量水分的吸收，其具有 可以用于预防和/或治疗任何类型腹泻的优势，尤其是无论该腹泻是否为传染源性或非传 染源性，以及有无菌丛失衡（dysbiosis)存在。
[0019] 因此，本发明涉及选择用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株的方法，该方法包 含以下步骤：
[0020] -测量至少一种测试菌株对至少一种涉及结肠中水分吸收或分泌的转运体的表达 的影响，和
[0021] -选择至少一种引起至少一种涉及结肠中水分分泌的转运体表达减少和/或至少 一种涉及结肠中水分吸收的转运体的表达增加的菌株。
[0022] 更具体地，在第一个方面，本发明涉及选择用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌 株的方法，该方法包含以下步骤：
[0023]-测量至少一种测试菌株对CFTR蛋白（囊性纤维化跨膜转导调节因子）的表达和 /或NHE3蛋白（钠氢交换体3)的表达的影响，和
[0024]-选择至少一种引起CFTR蛋白的表达减少及/或NHE3蛋白的表达增加的菌株。
[0025] 在某些实施方案中，该测试菌株为酵母菌株或细菌菌株。具体地，待测试的细菌菌 株可为芽孢杆菌菌株，优选为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)菌株。
[0026] 在某些实施方案中，CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的表达通过电泳、蛋白质印迹、免 疫分析、免疫组织化学、免疫细胞化学、质谱、RT-PCR或RNA印迹测量。
[0027] 在另一个方面，本发明涉及使用根据本发明方法选择的用于治疗和/或预防腹泻 的益生菌菌株。
[0028]在某些实施方案中，益生菌菌株为枯草芽孢杆菌菌株，优选以保藏号1-2745于 2001 年 10月 25 日保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes/ 国家微生物菌种保藏中心，25rue du Docteur Roux，75724Paris Cedex 15)的枯草芽抱杆 菌菌株CU1。
[0029] 在一个次要的方面，本发明涉及通过培养根据本发明方法选择的益生菌菌株所得 的用于治疗和/或预防腹泻的细胞。
[0030] 具体地，本发明涉及通过培养以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏于CNCM 的枯草芽孢杆菌菌株CU1所得的用于治疗和/或预防腹泻的枯草芽孢杆菌细胞。
[0031] 本发明还涉及在患者中治疗和/或预防腹泻的方法，其包含向所述患者施用有效 量的通过培养根据本发明方法选择的益生菌菌株所得的细胞。
[0032] 在某些实施方案中，治疗和/或预防腹泻的方法包含施用通过培养枯草芽孢杆菌 的益生菌菌株所得的枯草芽孢杆菌细胞，优选以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏 于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1。
[0033] 在另一个方面，本发明涉及用于治疗和/或预防腹泻的组合物，所述组成物包含 至少一种根据本发明的益生菌菌株，或通过培养所述菌株所得的细胞。具体地，所述组合物 包含通过培养以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株⑶1 所得的枯草芽孢杆菌细胞。
[0034] 可根据本发明预防性和/或治疗性治疗的腹泻形式包括急性腹泻和慢性腹泻。
[0035] 在某些实施方案中，根据本发明治疗的腹泻是由病毒、细菌或寄生性病原体引起 的传染源性的腹泻。
[0036] 在其他实施方案中，根据本发明治疗的腹泻是非传染源性的腹泻。
[0037] 非传染源性的腹泻是，例如由食品不耐受引起的腹泻、由脂肪饮食引起的腹泻、由 酒精引起的腹泻、由心理因素引起的腹泻、由施用医药产品引起是腹泻、由施用治疗程序引 起的腹泻、与疾病或临床病况相关的腹泻、或与停药相关的腹泻。
[0038] 以下给出本发明的某些优选实施方案的更详细描述。
[0039] 发明详沐
[0040] 如上文所述，本发明涉及鉴定能通过直接作用于涉及调控肠液的转运体水平而作 用于结肠中水分吸收的益生菌菌株，及其作为治疗和/或预防腹泻的医药产品的用途。
[0041]I.选择益生菌菌株的方法
[0042] 根据本发明的选择方法的目标是鉴定可用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株。
[0043] 因此，本发明涉及选择用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株的方法，该方法包 括以下步骤：
[0044]-测量至少一种测试菌株对至少一种涉及结肠中水分吸收或水分分泌的转运体的 表达的影响，和
[0045]-选择至少一种引起至少一种涉及结肠中水分分泌的转运体的表达减少及/或至 少一种涉及结肠中水分吸收的转运体的表达增加的菌株。
[0046] 涉及结肠中水分分泌的转运体的一个实例是CFTR蛋白（囊性纤维化跨膜转导调 节因子）。
[0047] 涉及结肠中水分吸收的转运体的一个实例是NHE3蛋白（钠氢交换体3)。
[0048] 根据本发明的一种优选方法的特征在于，它包含以下步骤：
[0049]-测量至少一种测试菌株对CFTR蛋白的表达和/或NHE3蛋白的表达的影响，和
[0050] -选择至少一种引起CFTR蛋白的表达减少和/或NHE3蛋白的表达增加的菌株。
[0051] 因此，根据本发明的方法选出的菌株是可用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌 株。
[0052] 本文中"益生菌菌株"意欲是指能对宿主健康发挥有益效果的活微生物菌株。 [0053] 宿主通常是人，但可以想见的是，宿主可以是另一种哺乳动物，例如狗、猫、反刍动 物，尤其是绵羊、山羊、犊牛、乳牛、鹿科动物、骆驼科动物、马科动物、旧大陆猪（Old-World swine)，尤其是猪和小猪、兔科动物、鼠科动物、及膝鼠科的嗤齿动物。
[0054] 测试菌株
[0055] 欲使用本发明方法测试的菌株可为任何微生物菌株。
[0056] 在某些实施方案中，所述测试菌株是酵母菌株。在可测试的酵母中，可以提及例如 酵母（Saccharomyces)属的酵母，尤其是布拉酵母菌（Saccharomyces boulardii)种、酿酒 酵母（Saccharomyces cerevisiae)种，克鲁维酵母菌（Kluyveromyces)属的酵母，尤其是 马克斯克鲁维（Kluyveromyces marxianus)种。
[0057] 在其他实施方案中，待测菌株为细菌菌株。
[0058] 优选地，所述测试菌株选自被认