或从结肠分离的T84细胞。
[0102] 这些细胞系可从，例如ATCC(美国菌种保存中心）购得。
[0103] 在某些实施方案中，所述生物样本是从表达目标蛋白质，尤其是CFTR蛋白和/ 或NHE3蛋白的细胞或组织中分离的蛋白质提取物。提取蛋白质的方法是本领域技术人 员熟知的（参见，例如"Protein Methods", D. M. Bollag 等，2nd Ed.，1996, Wiley-Liss; "Protein Purification Methods:A Practical Approach", E. L. Harris and S. Angal (Eds. )，1989 ;''Protein Purification Techniques: A Practical Approach'S. Roe, 2nd Ed. , 2001, Oxford University Press /'Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification, and Characterization"，H. Ahmed, 2005, CRC Press:Boca Raton, FL)。还有用于从组织或从生物体液中提取蛋白质的试剂盒。这类试剂盒由，例如 BioRad Laboratories(Hercules, CA)、BD Biosciences Clontech(Mountain View, CA)、 Chemicon International,Inc. (Temecula,CA)、Calbiochem(SanDiego, CA)、Pierce Biotechnology (Rockford, IL)和 Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA)销售。
[0104] 本领域技术人员知道如何选择最适合情况的试剂盒。
[0105] 测试菌株的影响
[0106] 在根据本发明的方法中，测试菌株对涉及结肠中水分吸收或分泌的转运体的表 达，尤其是CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的表达的影响是通过比较从已使用该测试菌株治疗 过的模式动物取得的生物样本中测得的目标蛋白质的表达量与未使用该测试菌株治疗过 的模式动物（相同种类）取得的生物样本（相同种类）中测得的目标蛋白质的表达量来进 行测定。最后提及的动物称为对照动物。
[0107]因此，例如当应用其中生物样本来自模式动物的本发明方法时，向所述模式动物 施用指定量的通过培养该测试菌株所得的细胞。
[0108] 该细胞量可一次施用。
[0109] 或者，该细胞量可分成几次施用，无论是在同一天、或在数天、或数周之内施用。
[0110] 通过培养测试菌株所得的细胞可通过适合所用模式动物的任何施用方法施用。例 如，施用可通过注射，尤其是通过胃内注射含有合适载体及指定量的通过培养该测试菌株 所得的细胞的溶液或悬浮液进行。向对照动物施用仅包含载体的相同体积的溶液。
[0111] 再者，当应用其中该生物样本为细胞系的本发明方法时，测试菌株的影响是通过 比较在已使用该测试菌株治疗过的细胞系的细胞上测得的目标蛋白质的表达量与在未使 用该测试菌株治疗的（相同细胞系）细胞上测得的目标蛋白质的表达量来进行测定。这些 最后提及的细胞称为对照细胞。
[0112] 因此，例如当应用其中该生物样本为细胞系的本发明方法时，细胞系的细胞与指 定量的含有合适载体和指定量的通过培养测试菌株所得的细胞的溶液或悬浮液一起孵育。 所述细胞系的对照细胞在同样条件下，仅含有所述载体的相同体积的溶液中孵育。
[0113] 培养菌株，无论是酵母菌株或细菌菌株，的方法是本领域已知的，且本领域技术人 员知道如何就各菌株的性质来优化培养条件。
[0114] 再者，本领域技术人员知道如何确定通过培养测试菌株所得的细胞在向模式动物 施用或与细胞株系细胞一起孵育时的最佳数量。
[0115]例如，枯草芽孢杆菌细胞是通过在培养基中培养枯草芽孢杆菌菌株所得，尤其是， 如 Biotechnology, 5th edition, R. Scriban，Edition Tec. &Doc.，1999,ISBN:2-7430-0309 _X 一书中所述。
[0116] 通常，通过培养枯草芽孢杆菌菌株来产生枯草芽孢杆菌细胞的方法包含以下步 骤：
[0117]-用枯草芽孢杆菌菌株的接种物接种培养基，
[0118]-在有氧条件下培养以达到细胞增殖，
[0119] _将生物质从其培养基中分离以获得枯草芽孢杆菌细胞。
[0120] 由此所得的枯草芽孢杆菌细胞主要为繁殖体形式。
[0121] 表述"主要为繁殖体"意味着至少70 %的细胞是繁殖体，优选至少80%，更优选至 少 90%。
[0122] 细菌的"繁殖体形式"是指置于有利条件下的细菌形式。
[0123] 有利条件的一个实例是在有利于细菌繁殖的温度和pH值下的非限制性培养基。
[0124]非限制性培养基含有细胞繁殖必需的所有营养素。
[0125] 产生枯草芽孢杆菌细胞的方法还可包含介于在有氧条件下培养的步骤与分离生 物质的步骤之间的将细胞置于不利条件下的中间步骤。因此，在生产方法结束时所得的枯 草芽孢杆菌细胞主要为孢子形式。
[0126] 表述"主要为孢子形式"意味着至少有70%的细胞是孢子形式，优选至少80%，更 优选至少90%。
[0127] 细菌的"孢子形式"是指置于不利条件下的细菌形式。因此，孢子形式是一种使细 菌能够抵抗艰困环境，例如缺少营养物，即限制性营养培养基、水分压力、pH值或温度的变 化很大、或通过消化道的抵抗形式。
[0128] 将细菌细胞置于不利条件下可通过，例如以下方式达成：不更新细菌的培养基、停 止向培养基进料、使用限制性培养基、改变温度、改变pH值或它们的组合。
[0129]产生枯草芽孢杆菌细胞的方法还可以包含进一步干燥该细胞的步骤，以或得干燥 形式的枯草芽孢杆菌细胞。
[0130] 表述"干燥形式的枯草芽孢杆菌细胞"意指在产生枯草芽孢杆菌细胞的方法结束 时所得的生物质包含超过90%的干燥物质，优选超过95%的干燥物质。
[0131] 所述干燥是通过，例如冷冻干燥、流化床干燥或喷雾干燥进行。
[0132] 用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株的鉴定
[0133] 通过比较使用测试菌株处理的样本中所测得的目标蛋白质的表达量与对照样本 中所测得的目标蛋白质的表达量，可能确定所述测试菌株是否能引起目标蛋白质的表达减 少或增加，或对所述表达没有影响。
[0134] 如上述指出，已通过本发明的选择方法测定能引起至少一种涉及结肠中水分分泌 的转运体的表达减少和/或至少一种涉及结肠中水分吸收的转运体的表达增加的菌株是 可用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株。
[0135] 本发明人已表明，这类益生菌菌株能够引起结肠中存在的过量水分的吸收，因而 发现能应用于治疗和/或预防腹泻。
[0136] "涉及结肠中水分分泌的转运体的表达减少"是指相对于没有该测试菌株存在时 的表达，所述转运体的表达显著减少。
[0137] 所述减少的"显著"特征是通过统计分析确定。
[0138] 当通过免疫组织化学测量对所述转运体的表达的影响时，"转运体的表达减少"是 指对应所述转运体表达的荧光强度/ ym2相对于没有该测试菌株存在时的表达显著减少。
[0139] "涉及结肠中水分吸收的转运体的表达增加"是指相对于没有该测试菌株存在时 的表达，所述转运体的表达显著增加。
[0140] 所述增加的"显著"特征是通过统计分析确定。
[0141] 当通过免疫组织化学测量对所述转运体的表达的影响时，"转运体的表达增加"是 指对应所述转运体表达的荧光强度/ ym2相对于没有该测试菌株存在时的表达显著增加。
[0142] 如本领域技术人员所理解，用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株可仅使用根据 本发明的一种选择方法鉴定。根据本发明的方法可使用单一类型的生物样本，例如指定的 模式动物，或使用数种类型的生物样本，例如一种细胞系，然后至少一种模式动物进行。
[0143] 或者，能作用于结肠中水分吸收的益生菌菌株的鉴定可以使用根据本发明的选择 方法进行，再以本领域技术人员所熟知的一系列测试和临床试验补充所述选择。
[0144] II.益生菌菌株用于治疗和/或预防腹泻的用途
[0145] 本发明涉及任何通过本发明方法鉴定的能够引起结肠中过量水分的吸收，以用于 治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株。本发明还涉及这类益生菌菌株在制备用于治疗和/或 预防腹泻的医药产品中的用途。
[0146] 如上文所指出，所述益生菌菌株可以是任何微生物菌株，尤其是酵母菌株或细菌 菌株，例如上文中所提及的那些。
[0147] 具体地，本发明者已表明，以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的 枯草芽孢杆菌菌株CU1是对结肠中过量水分的吸收起作用的益生菌菌株，因而可用于治疗 和/或预防腹泻。
[0148] 所述菌株已描述于文献FR 2837835中，其公开了用于胃肠道黏膜水平免疫的包 含所述菌株的活佐剂。
[0149] 本发明还涉及所有通过培养由本发明方法鉴定的益生菌菌株所得的酵母细胞或 细菌细胞用于治疗和/或预防腹泻的用途。
[0150] 如上文所指出，菌株的培养条件为本领域所周知，或容易由本领域技术人员确定。
[0151] 具体地，本发明涉及通过培养以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏于CNCM 的枯草芽孢杆菌菌株CU1所得的细胞用于治疗和/或预防腹泻的用途。
[0152] 以下，所述"通过培养以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草 芽孢杆菌菌株CU1所得的细胞"被称为"CU1细胞"。
[0153] ⑶1细胞的产生可按照上文所述进行。
[0154] 用于治疗和/或预防腹泻的CU1细胞是孢子形式和/或繁殖体形式的细胞。
[0155] 在一个优选的实施方案中，所述CU1细胞主要是孢子形式。
[0156] 在一个优选的实施方案中，所述用于治疗和/或预防腹泻的CU1细胞是干燥形式。
[0157] 在本发明的一个特别有利的实施方案中，所述用于治疗和/或预防腹泻的CU1细 胞主要是孢子形式且是干燥形式。
[0158] 本发明还涉及任何益生菌酵母细胞提取物或益生菌细菌细胞提取物，和来自益生 菌菌株培养物的任何滤液，所述提取物或滤液能够引起CFTR蛋白的表达减少和/或NHE3 蛋白的表达增加，因此能够引起结肠中过量水分的吸收。
[0159] 根据本发明的用于治疗和/或预防腹泻的方法包含向患者施用有效量的酵母细 胞或细菌细胞，所述酵母细胞或细菌细胞是通过培养由本文所述的方法鉴定的益生菌菌株 来获得。所述可以一个或多个剂量施用的酵母细胞或细菌细胞的有效量可由医师决定。根 据患者的年龄、体重及总体状况、腹泻的性质和严重程度等，待施用的确