均值土 SEM，n = 10-19)。T-:接受生理盐水注射，未以⑶1处理的小鼠；T+: 接受蓖麻油注射的未用⑶1处理的小鼠；T-/⑶1:接受生理盐水注射的用⑶1处理的小鼠； T+/⑶1:接受蓖麻油注射的用⑶1处理的小鼠。*相对于T-，P〈0. 05 ;t相对于T+，P〈0. 05
【具体实施方式】
[0206] 下列实施例描述本发明的一些实施方案。然而，应当理解这些实施例的呈现仅用 于说明目的，而不以任何方式限制本发明的范围。
[0207] 实施例1:意欲用于预防及/或治疗腹泻的益生菌菌株的选择
[0208] 材料和方法
[0209] 测试的益生菌菌株。
[0210] 测试的菌株如下：植物乳杆菌菌株和枯草芽孢杆菌株CU1。
[0211] 所使用的枯草芽孢杆菌CU1 (以下称为CU1)的细胞是孢子形式且是干燥的。
[0212] 所使用的植物乳杆菌（以下称为LR)的细胞是冻干的繁殖体形式。
[0213] 益生菌菌株对CFTR和NHE3表达的效果的测量。
[0214] 四只小鼠各用109CFU/天的⑶1处理2周。
[0215] 四只小鼠各用109CFU/天的LR处理2周。
[0216] 四只未用⑶1处理的小鼠用作对照。
[0217] 如下所述，通过免疫组织化学测量从用⑶1处理的小鼠和对照小鼠中取得的结肠 细胞上的CFTR和NHE3的表达。
[0218] 将小鼠处死后，即刻用0. 9% NaCl溶液洗涤近端结肠样本（1cm长），在4%甲醛缓 冲溶液中固定（6h)并在4°C浸没于30%蔗糖溶液中24小时。
[0219]将样本固定在 Tissue Tek 培养基（Euromedex，Souffelweyersheim，France)中， 并将其在_45°C冷冻于异戊烷中。用丙酮进行冷冻切片的后固定（10分钟，_20°C )并在 磷酸盐缓冲的生理盐水（PBS)-奶溶液中水合。在封闭液（带有含有0.1%牛血清白蛋白 (BSA)的0. 25%Triton X-100的PBS)中孵育后，将切片与兔子抗小鼠CFTR(1/100)、抗小 鼠 NHE3(l/200)或抗小鼠 TLR4(1/100)多克隆抗体（Abeam，Cambridge, UK)在 4°C下孵育 过夜。然后，将切片与FITC标记的驴抗兔抗体（1/2000, Uptima，M〇ntlu<?〇n，France) 在室温下孵肓1小时。然后，将切片封固在"Vectashield HardSet封固剂"（Abcys，Les Ulis, France)中，并在Nikon 90i 焚光显微镜（Nikon, Champigny_sur_Marne，France)下检 查。用Nis-Elements Ar软件（Nikon)测量免疫标记的荧光强度/ym2。在来自一组4只 小鼠的5个切片上进行分析。
[0220] 结果
[0221] 在测试的益生菌菌株中，仅发现枯草芽孢杆菌菌株⑶1对涉及通过结肠黏膜的水 分运动的两种转运体CFTR和NHE3的表达具有影响。实际上，如图1所示，用枯草芽孢杆菌 菌株CU1处理小鼠两周导致健康小鼠结肠中的结肠细胞顶极上的CFTR的表达明显减少。如 图2所示，用枯草芽孢杆菌菌株CU1处理小鼠两周导致健康小鼠结肠中的结肠细胞顶极上 的NHE3的表达明显增加。
[0222] 相反，如图3和图4所示，用植物乳杆菌株处理并未明显改变CFTR或NHE3的表达。
[0223] 实施例2:益生菌菌株⑶1用于预防和/或治疗腹泻的用途
[0224] 材料和方法
[0225] LPS诱导的腹泻模式
[0226] 向雄性DBA/2小鼠通过胃内途径施用待评估的109CFU/天/动物的益生菌菌株14 天。
[0227]然后，通过静脉内施用200L水处理对照组中的小鼠（12只小鼠），而测试组中 的小鼠（12只小鼠）则接受静脉施用的剂量为15mg/kg的肠炎沙门氏菌（Salmonella enteriditis)脂多醋（LPS) (Sigma，Saint Quentin Fallavier, France)，以诱导腹泻。注射 LPS后，将小鼠放置在单独的笼子中，地板上覆盖铝片以允许每隔30分钟收集粪便，共120 分钟。将收集的粪便物质称重，并在l〇〇°C加热24h，再次称重。粪便物质的湿重（加热前） 与干重之间的差值对应于排泄的水分。相对于施用LPS后的全部水分排泄来评估腹泻。
[0228] 由蓖麻油诱导的腹泻模式
[0229] 向雄性NMRI小鼠通过胃内途径施用待评估的109CFU/天/动物的益生菌菌株14 天。
[0230] 通过胃内途径施用200L水处理对照组中的小鼠（12只小鼠），并通过胃内途径向 "测试"组中的雄性NMRI小鼠（12只小鼠）施用200 iiL蓖麻油（Sigma)，以诱导腹泻。施用 蓖麻油后，将小鼠放置在单独的笼子中，地板上覆盖铝片以允许每隔30分钟收集粪便，共 180分钟。将收集的粪便物质称重，并在100°C加热24h，再次称重。粪便物质的湿重（加热 前）与干重之间的差值对应于排泄的水分。相对于施用蓖麻油后的全部水分排泄来评估腹 泻。
[0231] 由抗生素诱导的腹泻模式
[0232] 使用数量减少的抗生素建立由抗生素诱导的腹泻的动物模式（基于Chen等， 2008, Gastroenterology，135 (6) : 1984-92的工作）。施用抗生素引起菌群生态失调（不平 衡）和免疫反应，以及小鼠肠道黏液产生细胞的数量改变。抗生素处理能显著诱导艰难梭 状芽孢杆菌的出现。
[0233] 在此模式中，以109CFU/天/动物的速率向一组5只小鼠施用共14天及18天，来 测试使用CU1菌株的预防性治疗。使用CU1菌株7天后，将5种抗生素的混合物在饮用水 中施用3天，然后在第二天，用抗生素处理的小鼠接受腹膜内注射克林霉素。在实验开始后 的第14天和第18天观察处理效果。用CU1菌株处理的小鼠在整个测试中均接受该菌株。
[0234] 结果
[0235] 在各种小鼠的腹泻模式中测试枯草芽孢杆菌菌株CU1。
[0236] 枯草芽孢杆菌菌株⑶1的止泻性能
[0237] 如图4和图5所示，明显地发现菌株⑶1显著预防了由LPS(图5)和由蓖麻油诱 导的腹泻（图6)。
[0238] 实际上，CU1细胞的施用显著减少了在施用LPS后的第一个小时内粪便中所排泄 的水分（在4个测试中，减少的百分比为35%、38%、36%和40% )。
[0239] 在由蓖麻油诱导的腹泻模式中，CU1细胞的施用显著减少了在第二个小时内粪便 中所排泄的水分（在3个测试中，减少的百分比为63%、46%、44% )。
[0240] ⑶1菌株还对由施用抗生素诱导的腹泻具有预防效果。此效果在用⑶1细胞进行 预防性处理后观察到：该小鼠然后显示出肠道菌群正常化，以及在肠黏膜的黏液产生细胞 和巨噬细胞水平上由抗生素引起的变化的改善。
[0241] 与洛哌丁胺的效果的比较
[0242] 发现用CU1菌株预防性处理15天其减少由LPS或蓖麻油诱导的腹泻的效果与腹 泻开始前1小时经口服途径施用单剂量（lmg/kg)的洛哌丁胺（参考的止泻分子）相同。施 用LPS后，洛哌丁胺可减少50%粪便中排泄的水分（CU1为40% )，施用蓖麻油后，其可减少 60%粪便中排泄的水分（⑶1为60% )。
[0243] 结论
[0244] 在体内，枯草芽孢杆菌菌株CU1能够改善结肠在过量流体状况中的吸收能力。
[0245] 另外的研究表明枯草芽孢杆菌菌株CU1 :
[0246] -在蓖麻油模式和LPS模式中对小肠的分泌/吸收能力没有影响，
[0247] _取消结肠壁水平的由LPS诱导的旁细胞渗透性增加，但由蓖麻油诱导的则不，
[0248] -降低结肠壁水平的由蓖麻油诱导的短路电流，这表明在由蓖麻油诱导的泻药腹 泻的情况下结肠吸收水分的能力加强（但在基线情况下则不）。
[0249] 因此，枯草芽孢杆菌菌株CU1及通过培养此菌株所得的细胞可用于治疗和/或预 防任何类型的腹泻。
【主权项】
1. 一种选择用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株的方法，所述方法包含以下步骤： -测量至少一种测试菌株对至少一种涉及结肠中水分分泌的转运体或至少一种涉及结 肠中水分吸收的转运体的表达的影响，和 -选择至少一种引起至少一种涉及结肠中水分分泌的转运体的表达减少和/或至少一 种涉及结肠中水分吸收的转运体的表达增加的菌株。2. 如权利要求1所述的选择方法，所述方法包含以下步骤： -测量至少一种测试菌株对CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的表达的影响，和 -选择至少一种引起CFTR蛋白表达减少和/或NHE3蛋白表达增加的菌株。3. 如权利要求1或2所述的选择方法，其特征在于，所述测试菌株是酵母菌株或细菌菌 株。4. 如权利要求3所述的选择方法，其特征在于，所述细菌菌株是芽孢杆菌菌株，优选枯 草芽孢杆菌菌株。5. 如权利要求1-4任一项所述的选择方法，其特征在于，所述CFTR蛋白和/或NHE3 蛋白的表达通过电泳、蛋白质印迹法、免疫分析法、免疫组织化学法、免疫细胞化学法、质谱 法、RT-PCR或RNA印迹法测量。6. -种引起至少一种涉及结肠中水分分泌的转运体的表达减少和/或至少一种涉及 结肠中水分吸收的转运体的表达增加的益生菌菌株、通过培养所述益生菌菌株所得的细 胞、或包含所述益生菌菌株或所述细胞的组合物用于治疗和/或预防腹泻的用途。7. 如权利要求6所述的益生菌菌株、细胞或组合物用于治疗和/或预防腹泻的用途，其 中所述益生菌菌株为枯草芽孢杆菌菌株。8. 如权利要求7所述的益生菌菌株、细胞或组合物用于治疗和/或预防腹泻的用途，其 特征在于，所述益生菌菌株是以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽 孢杆菌菌株CUl。9. 如权利要求6-8任一项所述的益生菌菌株、细胞或组合物用于治疗和/或预防腹泻 的用途，其特征在于，所述腹泻是急性腹泻或慢性腹泻。10. 如权利要求6-9任一项所述的益生菌菌株、细胞或组合物用于治疗和/或预防腹泻 的用途，其特征在于，所述腹泻是传染源性腹泻或非传染源性腹泻。
【专利摘要】本发明涉及选择或鉴定能够作用于结肠中水分吸收的益生菌菌株的方法，及其作为用于治疗和/或预防腹泻的医药产品的用途。本发明尤其涉及用于治疗和/或预防腹泻的枯草芽孢杆菌菌株CU1。CNCM I-274520011025
【IPC分类】G01N33/569, G01N33/50
【公开号】CN105008924
【申请号】CN201380064960
【发明人】M·库翁雨, J·菲奥拉蒙蒂, M·雨尔达西
【申请人】乐斯福公司, 国家农艺研究院, 波尔多国立高等农业科学学校
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2013年12月12日
【公告号】CA2893990A1, EP2932265A1, WO2014091160A1