热稳定的dna聚合酶的表征的制作方法
【专利说明】热稳定的DNA聚合酶的表征
【背景技术】
[0001] 用于扩增核酸序列的聚合酶链式反应（PCR)方法是本领域众所周知的，且公开在 例如美国专利号4, 683, 202、4, 683, 195和4, 965, 188中。在PCR扩增的每个循环中，将双 链靶序列变性，使引物与变性的靶序列的每条链退火，并通过DNA聚合酶的作用来延伸(伸 长）引物。这些步骤可以分别总结为变性、退火和延伸步骤。在典型PCR所用的高温下，弓丨 物仅与预期的靶序列杂交。但是，扩增反应混合物通常在室温组装，远低于引物的杂交温 度。在这样的低严谨条件下，引物可能结合仅部分地互补的序列或其它引物并引发不希望 的延伸产物的合成。这些不希望的延伸产物与靶序列一起被扩增，且该扩增与期望的靶序 列的扩增竞争，从而降低特异性扩增的效率。本领域已知几种用于在PCR反应过程中增加 效率和减少非特异性扩增的方法。例如，最初如下进行热启动方法：在最初的高温温育步 骤以后手工打开反应试管，并加入缺少的试剂（例如DNA聚合酶）。通过开发化学修饰的 DNA聚合酶，进一步改进了该方法。化学修饰的DNA聚合酶是可逆的灭活聚合酶，其通过共 价修饰而灭活，所述共价修饰位于酶的活性部位或造成使该酶无活性的构象变化。所述化 学修饰可以被热逆转，由此将该酶转化成它的活性形式。因此，含有处于它的无活性形式的 DNA聚合酶的、预装配的反应混合物可以直接用于扩增，无需在第一个高温温育步骤以后添 加酶的额外步骤。化学修饰的DNA聚合酶和修饰它们的方法描述在美国专利号5, 773, 258 和 5, 677, 152 中。
[0002] 高质量DNA聚合酶可用于多种应用，诸如需要进行的PCR扩增的高效率和特异性 的、非常复杂的诊断试验。
【发明内容】
[0003] 本发明尤其提供了使用质谱法表征DNA聚合酶的方法。具体地，本文提供的方法 可以用于检测DNA聚合酶中的化学赖氨酸修饰，由此表征所述DNA聚合酶的活性水平。
[0004] 在一个方面，提供了检测赖氨酸修饰的DNA聚合酶中的共价赖氨酸修饰的数目的 方法。所述方法包括（i)在稳定修饰的pH检测赖氨酸修饰的DNA聚合酶的质量；和（ii) 通过将赖氨酸修饰的DNA聚合酶的质量与不含赖氨酸修饰的聚合酶进行对比，计算赖氨酸 修饰的DNA聚合酶中的赖氨酸修饰的数目，其中所述赖氨酸修饰的数目是所述赖氨酸修饰 的DNA聚合酶的质量与所述不含赖氨酸修饰的聚合酶之差除以所述赖氨酸修饰的质量，由 此检测所述DNA聚合酶中的赖氨酸修饰的数目。
[0005] 在某些实施方案中，通过DNA聚合酶与修饰试剂的反应，形成共价赖氨酸修 饰。在其它实施方案中，所述修饰试剂是二羧酸酸酐。在某些实施方案中，所述二羧酸酸 酐选自马来酸酐、柠康酸酐、顺式-乌头酸酐、2, 3-二甲基马来酸酐、外-顺式-3, 6-桥 氧-A4-四氢邻苯二甲酸酐和3, 4, 5, 6-四氢邻苯二甲酸酐。在某些实施方案中，所述共 价赖氨酸修饰是柠康酰基修饰。在某些实施方案中，所述共价赖氨酸修饰是乌头酰化的 (aconitylated)修饰。在某些实施方案中，所述共价赖氨酸修饰是2,3-二甲基马来酰化 (2,3-dimethylmaleated)的修饰。
[0006] 在某些实施方案中，所述赖氨酸修饰的DNA聚合酶的质量是计算机可读的质量。 在某些实施方案中，在计算机环境中构建不含赖氨酸修饰的聚合酶的质量，由此形成计算 机可读的标准质量。在某些实施方案中，所述计算是在计算机上进行。
[0007] 在某些实施方案中，所述稳定修饰的pH是至少8。在某些实施方案中，在步骤（i) 的检测即将开始之前和过程中，所述DNA聚合酶基本上不含有非离子去污剂。
[0008] 在某些实施方案中，所述方法进一步包括，在步骤（i)的检测之前，用酶将赖氨酸 修饰的DNA聚合酶片段化，所述酶在所述聚合酶内的已知位点处将所述聚合酶片段化。在 某些实施方案中，所述酶是胰蛋白酶。在某些实施方案中，所述方法包括，检测赖氨酸修饰 的DNA聚合酶的片段的质荷比，和将所述赖氨酸修饰的DNA聚合酶的片段的质量与不含赖 氨酸修饰的聚合酶的潜在片段的质量进行对比，由此确定所述聚合酶中的特定赖氨酸处的 赖氨酸修饰的位置。
[0009] 在某些实施方案中，一个或多个赖氨酸修饰会封闭酶，由此阻止一种或多种片段 的形成和/或增加得到的片段的大小。在某些实施方案中，所述方法包括，检测赖氨酸修饰 的DNA聚合酶的片段的相对量，和任选地将所述赖氨酸修饰的DNA聚合酶的片段的相对量 与不含赖氨酸修饰的聚合酶的潜在片段的预测相对量进行对比，由此确定所述聚合酶中的 特定赖氨酸处的赖氨酸修饰的相对水平。
[0010] 在某些实施方案中，赖氨酸修饰的位置对应于Taq GOLD聚合酶的氨基酸位置 540、663或738。在某些实施方案中，赖氨酸修饰的位置对应于Taq Z05聚合酶的氨基酸位 置 542、665 或 740。
[0011] 在某些实施方案中，本文提供的方法包括，检测在所述氨基酸位置处的修饰的相 对量，其中所述修饰的相对量是在所述位置处的修饰的赖氨酸的量除以在所述位置处的修 饰的和未修饰的赖氨酸的量的总和，由此检测所述位置处的修饰的相对量。
【附图说明】
[0012] 图1?四极飞行时间质量分析仪的简图（得自Siuzdak, G, "The Expanding Role of Mass Spectrometry in Biotechnology"）。
[0013] 图2. S Z05的完整分析：（A)总离子色谱图；(B)质谱图；(C)解卷积质量。S Z05 的理论质量是61，076. 04。通过质谱图的解卷积得到的质量是60, 874. 91，这与在18ppm (1. llamu)内的N-端甲硫氨酸和丙氨酸残基的丢失相符。
[0014] 图3.使用高pH完整分析来确定10-19个柠康酰基修饰在S Z05 GOLD上的总分 布。每个峰代表S Z05的质量+指定数目的柠康酰基修饰。
[0015] 图4.被修改成与LCMS相容的PCR主要混合物的分析。增加酶浓度，且排除盐、 dNTP、UNG和DMS0。该主要混合物在加速贮存条件下的分析指示柠康酰基修饰在高温下的 显著损失。在4°C的贮存表明4个月以后净损失2个修饰。
[0016] 图5.含有柠康酰基修饰百分比的、Taq GOLD和Z05 GOLD中的赖氨酸残基的图 谱。
[0017] 图6. Taq GOLD和Z05 GOLD的DNA聚合酶结构域中的赖氨酸残基的对比。Z05 GOLD具有5个额外赖氨酸的净值，它们都在某种程度上被修饰。在Taq中的K540、K663和 K738和在Z05中的它们的等同物都被严重修饰。缺少外切核酸酶结构域的Taq的分子模型 (前视图）指示，它们处于关键位置。
【具体实施方式】
[0018] I?定义 在本文中使用的缩写具有它们在化学和生物学领域中的常规含义。
[0019] "聚合酶"表示执行模板指导的多核苷酸合成的酶。DNA聚合酶可以仅向新形成的 链的3'末端添加游离核苷酸。这导致新形成的链在5'-3'方向的延伸。没有已知的DNA 聚合酶能够开始新链（从头）。DNA聚合酶可以仅向预先存在的3'-OH基团添加核苷酸，且 因此需要引物，它可以在所述引物处添加第一个核苷酸。引物可以包含例如RNA和/或DNA 碱基以及非天然存在的碱基。新形成的链（子链）的方向性与DNA聚合酶沿着模板链移动 的方向相反。聚合酶的非限制性例子包括原核DNA聚合酶（例如Pol I、Pol II、Pol III、 Pol IV和Pol V)、真核DNA聚合酶、端粒末端转移酶、逆转录酶和RNA聚合酶。逆转录酶是 从RNA模板合成DNA的、RNA依赖性的DNA聚合酶。逆转录酶家族含有DNA聚合酶功能性 和RNA酶H功能性，其降解与DNA发生碱基配对的RNA。RNA聚合酶是在基因转录过程中使 用DNA作为模板合成RNA的酶。RNA聚合酶在RNA转录物的3'末端处聚合核糖核苷酸。
[0020] 术语"热稳定聚合酶"是指对热稳定的酶，其是耐热的，当经受升高的温度并持续 影响双链核酸变性所必需的时间时，其保留足够的活性以影响随后的多核苷酸延伸反应， 并且没有变得不可逆变性的（失活的）。核酸变性所需的加热条件是本领域熟知的，在例 如美国专利号4, 683, 202、4, 683, 195和4, 965, 188中举例说明。如本文所述，热稳定聚 合酶适于在温度循环变化的反应如聚合酶链式反应（"PCR"）中使用。用于本文目的的 不可逆变性指酶活性的永久且完全的损失。对于热稳定聚合酶，酶活性是指以适当的方 式催化核苷酸的组合以形成与模板核酸链互补的多核苷酸延伸产物。来自嗜热菌的热稳 定DNA聚合酶包括，例如来自海栖热袍菌（TXerazo toga azari )、水生栖热菌（ a识嗜热栖热菌（黄栖热菌（Z7an/6〇、丝状栖 热菌（、栖热菌属种（species) spsl7、栖热菌属种（ species) Z05、热坚芽抱杆菌caJt/otenax)、那不勒斯栖 热袍菌（和非洲栖热腔菌（TXeiTffosijOAo 的 DNA 聚合 酶。
[0021] 本文中提供的"化学修饰的DNA聚合酶"表示具有至少一个共价地连接的修饰的 DNA聚合酶，所述修饰使得所述DNA聚合酶至少基本上无活性。在某些实施方案中，所述共 价修饰仅连接至DNA聚合酶的特定种类的氨基酸（例如，仅连接至赖氨酸，或仅连接至精氨 酸，等）。在某些实施方案中，所述修饰仅发生在氨基酸的已知集合处（例如，仅在赖氨酸和 精氨酸上等）。在某些实施方案中，所述修饰可以仅发生在聚合酶中的特定位点处（例如， 在特定子序列处）。在某些实施方案中，所述修饰连接至DNA聚合酶的赖氨酸。在所述修饰 连接至赖氨酸的情况下，所述DNA聚合酶被称作"赖氨酸修饰的" DNA聚合酶。
[0022] 术语"化学修饰的"和"可逆灭活的"在全文中互换使用，且与那些术语的平常普 通用法保持一致。因而，本文中提供的术语"可逆地无活性的"或"可逆地灭活的"表示所 有或几乎所有DNA聚合酶活性的可逆损失。所述修饰是"可逆的"，因为所述修饰可以在某 些条件（例如，热）下除去以产生基本上有活性的酶。
[0023] 本文中提供的术语"修饰试剂"表示能够与DNA聚合酶的氨基酸反应从而形成共 价氨基酸（例如赖氨酸修饰）的化学化合物。
[0024] "稳定修饰的pH"是使DNA聚合酶的化学修饰（例如共价赖氨酸修饰）保持基本 上稳定（连接至聚合酶）的pH。例如，在液相色谱法（LC)分离和随后对修饰的聚合酶的四 极飞行时间质谱法（Q