热稳定的dna聚合酶的表征的制作方法_3

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的级分分别储存用于以后分析。
[0036] 质谱法通常包括:将分析物(DNA聚合酶或其片段)电离以产生带电荷的分析物, 和测量所述分析物的质量。在操作过程中,将含有分析物(DNA聚合酶)的样品(例如聚合 酶贮存缓冲液或反应缓冲液)加载到MS仪器上并进行蒸发。然后通过多种方法之一,将样 品的组分电离。例如,在电喷射-MS (ESI)过程中,首先将分析物溶解在液体气溶胶微滴 中。在高电磁场和高温和/或干燥气体施加的影响下,微滴带上电荷且液体基质蒸发。所 有液体基质蒸发以后,电荷保持定位在被转移进质谱仪中的分析物分子上。在基质辅助的 激光解吸电离(MALDI)中,用激光束照射分析物和基质的混合物。这导致基质材料的定位 电离以及分析物和基质的解吸。认为分析物的电离通过电荷从基质材料向气相中的转移 而发生。关于电喷射电离(ESI)和基质辅助的激光解吸电离(MALDI)的详细描述,参见例 如 Mano N爭.AnaJ. Sciences 19 (1) (2003) 3-14。关于解吸电喷射电离(DESI)的 描述,参见 Takats Z 攀.Scieflce 306 (5695) (2004) 471-473。#尤,房%7, Karas, M.; Hillencamp, F.Anal. Chem.60:2301 1988) ;Beavis, R. C.Org.Mass Spec.27:653 (1992); Creel, H. S. 5bi. 1(11): 336 (1993)〇
[0037] 电离的样品组分然后可以根据它们的质荷比在质量分析仪中分离。在LC/MS中使 用的不同质量分析仪的例子包括、但不限于单个四极、三个四极、离子阱、T0F (飞行时间) 和四极-飞行时间(Q-T0F)。关于MS技术的详细描述,参见Mano N爭.AnaJ. Sciences 19 (1) (2003) 3-14。
[0038] 在某些实施方案中,进行通过DNA聚合酶中的赖氨酸残基与二羧酸酸酐的反应而 形成的共价赖氨酸-修饰的LC-MS检测。化学修饰的DNA聚合酶的贮存和反应缓冲液具 有8-9的碱性pH,其将赖氨酸修饰稳定化且确保可逆地灭活的DNA聚合酶在位于或低于延 伸温度的温度保持无活性。赖氨酸修饰是热和酸不稳定的,且因此不可以在标准LC规程常 用的流动相的酸性条件下分离。通过在稳定修饰的pH执行LC-方法,发明人已经解决了该 问题和本领域中的其它问题。在某些实施方案中,所述稳定修饰的pH是至少8。在其它实 施方案中,所述稳定修饰的pH是约8。在其它实施方案中,所述稳定修饰的pH是约8. 2、约 8. 4、约 8. 6、约 8. 8、约 9、约 9. 2、约 9. 4、约 9. 6、约 9. 8、约 10 或约 8-9、8-10 或 9-10。在某 些实施方案中,所述稳定修饰的pH是聚合酶贮存缓冲液pH。聚合酶贮存缓冲液pH表示在 其中储存聚合酶的缓冲液的pH。贮存缓冲液可以包括稳定聚合酶的组分和防腐剂(例如吐 温-20、DTT、甘油、EDTA),从而提供酶的长期贮存。在其它实施方案中,稳定修饰的pH是聚 合酶反应缓冲液pH。聚合酶反应缓冲液pH表示在其中进行PCR反应的缓冲液的pH。反应 缓冲液(或反应混合物)可以包括引物、核苷酸、盐以及已知可用于DNA扩增的稳定组分和 防腐组分。
[0039] 尽管在DNA聚合酶贮存和反应缓冲液中使用的稳定组分和防腐剂对于DNA聚合酶 的稳定性和性能而言有益,但是它们可能与质谱法不相容。例如,非离子去污剂吐温-20有 助于稳定相当疏水的DNA聚合酶,但是包括干扰离子并造成离子抑制,由此干扰质谱法检 测过程。因而,在某些实施方案中,所述方法包括,在质谱分析之前,从DNA聚合酶分离非离 子去污剂。在其它实施方案中,不在有任何或显著量的非离子缓冲剂存在下储存经修饰的 聚合酶。因而,在某些实施方案中,在步骤(i)的检测即将开始之前和过程中,所述DNA聚 合酶基本上不含有非离子去污剂。
[0040] 本文(包括其实施方案)提供的方法可以用于使用LC/Q-T0F质谱法检测经修饰的 DNA聚合酶的质量。在某些实施方案中,所述赖氨酸修饰的DNA聚合酶的质量是计算机可读 的质量。在将质谱法检测器连接至计算机实现的系统的情况下,且在所述计算机实现的系 统将来自检测器的电子信号转化成质谱图由此形成计算机可读的质量的情况下,形成计算 机可读的质量。计算机实现的系统可以用在本文提供的方法中,以计算不含赖氨酸修饰的 DNA聚合酶的质量从而形成计算机可读的标准质量。因而,在某些实施方案中,在计算机环 境中构建不含赖氨酸修饰的聚合酶的质量,由此形成计算机可读的标准质量。
[0041] 为了计算经修饰的DNA聚合酶中的修饰(包括、但不限于赖氨酸修饰)的数目,将 经修饰的DNA聚合酶的质量(例如,计算机可读的质量)与不含修饰的聚合酶的质量(例如 计算机可读的标准质量)进行对比。通过计算经修饰的DNA聚合酶的质量和不含修饰的聚 合酶的质量的差异,并将所述差异除以修饰本身的质量,确定与聚合酶连接的修饰的数目。
[0042] 在某些实施方案中,所述计算是在计算机上进行。因此,在某些实施方案中,"计 算"表示使用计算机实现的算法来计算DNA聚合酶中的化学(赖氨酸)修饰的数目。所述 计算可以通过准确质量算法来执行,以基于被发现与确切分子量有关的离子集合(有关的 ?/4t)而定位分子实体或"化合物"。计算机实现的算法可以执行经修饰的DNA聚合酶的 质量和不含修饰的聚合酶的质量的差异的计算,并将所述差异除以修饰的质量以确定修饰 的数目。在某些实施方案中,所述计算机实现的算法是准确质量算法。准确质量算法基于 被发现与确切分子量有关的离子集合(有关的?/^!)而定位分子实体或"化合物"。
[0043] 如上所述,本文提供的方法可以用于检测DNA聚合酶中的化学修饰(赖氨酸修饰) 的程度。此外,本文提供的方法也可以用于检测DNA聚合酶中的化学修饰(例如赖氨酸修 饰)的位置。本文提供的方法可以用于检测存在于如上所述的未片段化的DNA聚合酶中或 存在于片段化的DNA聚合酶中的赖氨酸修饰。本文提供的片段化的DNA聚合酶是已经用酶 (蛋白酶)消化过的聚合酶,所述酶(蛋白酶)能够在所述聚合酶内的已知部位处水解蛋 白。在某些实施方案中,所述酶是胰蛋白酶。
[0044] 在所述方法包括检测片段化的DNA聚合酶的情况下,可以在检测化学修饰的(赖 氨酸修饰的)DNA聚合酶的质量之前进行蛋白酶消化。因而,在某些实施方案中,所述方法 进一步包括,在检测步骤之前,用酶将修饰的(例如,赖氨酸修饰的)DNA聚合酶片段化,所 述酶在所述聚合酶内的已知位点处将所述聚合酶片段化。然后检测经修饰的DNA聚合酶的 片段的质量,并与不含赖氨酸修饰的聚合酶的潜在的(预测的)片段的质量进行对比。因 而,在某些实施方案中,所述方法进一步包括,检测经修饰的DNA聚合酶的片段的质荷比, 和将经修饰的DNA聚合酶的片段的质量与不含修饰的聚合酶的潜在片段的质量进行对比, 由此确定聚合酶中的特定位点(例如,赖氨酸)处的修饰的位置。在某些实施方案中,赖氨 酸修饰的位置对应于Taq GOLD聚合酶的氨基酸位置540、663和/或738。在其它实施方 案中,赖氨酸修饰的位置对应于Z05 GOLD聚合酶的氨基酸位置542、665和/或740。术语 "Gold"指示,基础聚合酶(例如,在实施例中的Taq或Z05)已经在赖氨酸残基处用二羧酸 酸酐化学修饰过。Taq和Z05聚合酶氨基酸序列是已知的,且描述在例如美国专利公开号 2012/0258501 中。
[0045] 在一些其它的实施方案中,一种或多种修饰会封闭酶,由此阻止一种或多种片段 的形成和增加得到的片段的大小。例如,在所述酶是胰蛋白酶且所述赖氨酸修饰是柠康酰 基修饰的情况下,所述柠康酰基修饰可以阻止在柠康酰化的赖氨酸处的水解。因此,在柠康 酰化的赖氨酸处不会发生裂解,从而产生与从未修饰的DNA聚合酶衍生出的相同肽(片段) 相比更大尺寸的肽(片段)。在某些实施方案中,所述经修饰的DNA聚合酶包括2个切割位 点,其中之一携带修饰。因此,所述酶在未修饰的位点处裂解,而第二个位点由于修饰而保 持不被裂解。酶裂解导致片段AB和片段C的形成。未修饰的DNA聚合酶的相同裂解可以 形成片段A、片段B和片段C。通过与未修饰的DNA聚合酶中的片段A、B和C的质量进行对 比,可以计算经修饰的DNA聚合酶中的片段的总数的质量。因此,将质量计算为片段AB的 质量、AB中的修饰的质量和片段C的质量的总和。在某些实施方案中,通过计算机实现的 算法执行计算。
[0046] 本文提供的方法可以进一步用于检测特定残基(例如Taq GOLD聚合酶的残基 540、663或738)处的修饰的相对量。"相对量"表示特定氨基酸残基在经修饰的酶中的特 定位置处的比例。作为一个例子,聚合酶样品可以包含在样品中的60%的聚合酶的特定位 置处的经修饰的残基,而其它40%是未修饰的(指示,例如,聚合酶样品是不完全修饰的,且 因而可能是有活性的,尽管在聚合酶的其它拷贝上有修饰)。PCR反应缓冲液可以含有DNA 聚合酶,其中在特定残基处的修饰的相对量在存在于所述缓冲液中的各个DNA聚合酶分子 之间变化。在这些DNA聚合酶分子中的特定残基处的修饰的相对量与各个分子的化学灭活 水平有关,且因此提供了关于DNA聚合酶在缓冲液中的活性的信息。因而,在某些实施方案 中,所述方法包括,检测在所述氨基酸位置处的修饰的相对量,其中所述修饰的相对量是在 所述位置处的修饰的赖氨酸的量除以在所述位置处的修饰的和未修饰的赖氨酸的量的总 和,由此检测所述位置处的修饰的相对量。这样的信息随后可以与预测的聚合酶活性(或 以活性方式)相关联,且在生产灭活的酶时可以用于例如质量控制中。
[0047] 本文提供的方法也可以用于确定在DNA聚合酶中的特定残基(例如赖氨酸)处的 化学修饰的相对水平。因而,在某些实施方案中,所述方法包括,检测赖氨酸修饰的DNA聚 合酶的片段的相对量,和任选地将所述赖氨酸修饰的DNA聚合酶的片段的相对量与不含赖 氨酸修饰的聚合酶的潜在片段的预测相对量进行对比,由此确定所述聚合酶中的特定赖氨 酸处的赖氨酸修饰的相对水平。
[0048] III.实施例 本文提供了用于分析与所有制剂(即制造保留物、储备物、成批物和主要混合物)相容 的所有DNA聚合酶的方法。这些方法意图支持DNA聚合酶产品的生命周期中的所有区域。 质谱法的添加会提供分子水平表征,其可以潜在地扩展DNA聚合酶的基础理解。作为一种 研究工具,从质谱法产生的新数据可以用于阐明关于化学修饰的(GOLD) DNA聚合酶的生 产、贮存和使用的重要新信息。这些结果提供的信息潜在地可能导致改善过程和/或性能。 另一种研究应用是分析主要混合物中的DNA聚合酶。这类研究在评价对DNA聚合
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