酶的结构 完整性的环境影响（即温度、贮存和PCR循环）中可能是有洞察力的。这些类型的分析还可 以在DNA聚合酶的生产和性能的故障查找中起作用。通过质谱法分析DNA聚合酶会添加新 维度来辅助制造、开发和产品护理。这种类型的分子表征的潜在应用包括：验证所有制剂中 的身份和定量，鉴别和/或监测蛋白降解，表征故意的和非故意的修饰，和优化贮存条件。
[0049] 本文提供的方法提供了以前难以得到的信息，即，基本序列测定、结构表征、点突 变和微异质性的鉴别。该技术向分子工具箱的添加会实现以下能力：证实身份，鉴别修饰、 突变和/或裂解，监测在分子水平的稳定性，和辅助开发新颖的DNA聚合酶。
[0050] 由于它的特别高的灵敏度和准确度，质谱法已经变成蛋白研究中的一种有用的且 被广泛采用的工具。用于蛋白分析的应用包括分子量测定、鉴别、定量和测序（1-8)。它也 被用于研究翻译后修饰、蛋白结构和非共价相互作用（9-13)。这些应用都属于QTOF LCMS 仪器的能力。从质谱法得到的数据会提供表征DNA聚合酶的新途径。在可行性工作中，开 发了用于截短的DNA聚合酶的完整分析的方法。这提供了快速地鉴别和区分密切相关的分 子（即Stoffel片段和SZ05 DNA聚合酶)的新方法。另外，这些方法也可以用于鉴别降解、 修饰和/或裂解。这类方法可以在关于DNA聚合酶的制备和使用的问题解决中起作用。
[0051] 最近之前，检查DNA聚合酶和特别是化学修饰的（GOLD)酶中的异质性的能力是非 常有限的。最近，开发了这样的LCMS方法，其能够：（1)表征能够对这些分子做出化学修饰 的位置，和（2)评估在分子水平对蛋白的改变。该工具实现了对GOLD酶的基础研究的起始， 包括化学修饰的局部变化、稳定性、在分子水平的再活化和在Taq Gold和Z05 Gold DNA聚 合酶之间的再活化差异。
[0052] 大多数DNA聚合酶的最终目的地是PCR主要混合物，最后在试剂盒中。典型浓度 可以是25-100 nM，这会禁止性地超过许多标准生化表征技术的能力。目前可得到的表征方 法是DNA聚合酶活性测定和银染色PAGE。两种方法都是十分灵敏的，但是易于发生某些量 的方法变化且不会常规地执行。已经将QTOF LCMS报道为具有在高飞摩尔（fmole)范围内 的蛋白定量限度，但是这高度依赖于化合物。本文提供了分析主要混合物中的DNA聚合酶 和评价它们对于定性和定量分析的有用性的方法。这些方法能够实现准确地定量酶浓度和 评价它在主要混合物中的结构完整性的能力。该工具可用于验证酶鉴别和浓度。它也可以 用于研究温度、贮存和PCR对DNA聚合酶的结构完整性的影响。
[0053] 通过用柠康酸酐共价地衍生化赖氨酸残基，会可逆地灭活聚合酶诸如GOLD DNA聚 合酶。在最近之前，不存在能够确定实际上衍生化了多少赖氨酸残基或许多赖氨酸残基中 的哪些实际上被衍生化的方法。本实施例使用LCMS QT0F方法，其能够鉴别GOLD DNA聚合 酶中的衍生化的赖氨酸残基。该技术能够在任意其它方式不可达到的分子水平充分表征 GOLD DNA聚合酶。该实现技术用于填充这些分子的基础知识中的缝隙，包括、但不限于衍生 化的残基的绘图；在残余物水平研究随着衍生化而变化的再活化动力学；获得热启动机制 的分子理解；确定批与批之间的变异性；提供一种可能的QC方法；优化涂镀（gilding)工 艺；潜在地工程改造改进的GOLD DNA聚合酶；研究和/或故障排除稳定性；和评价部分地 再活化的GOLD DNA聚合酶的性能。
[0054] 由Agilent QTOF LCMS提供的高分辨率和质量准确度能够实现这些类型的分析。 与CIT部分中的单个四极和离子阱质量分析仪相比，QT0F能够实现好300倍的质量准确度 和20倍的分辨率提高。组合的高质量准确度和高分辨率会使来自赋形剂分子的光谱干扰 最小化并实现达到第4个小数位的质量分配。
[0055] Agilent质谱仪由UPLC、恒温化的自动采样器和柱隔室、二极管阵列紫外检测器、 电喷射电离（ESI)源和四极飞行时间（QT0F)质量分析仪组成。ESI QT0F组合会提供非常 高的灵敏度、分辨率和准确度，它们用于明确地推导化合物的元素组成。四极可以用作简单 扫描分析仪或选择性地分离前体离子和将该离子导入碰撞细胞中进行片段化。T0F组分具 有超过10, 〇〇〇的上质荷比&/W和高分辨能力（1〇, 000-15, 000)。四极-T0F仪器可以用 作单个四极或串联MS实验。由于它的高准确度和灵敏度，ESI QT0F质谱仪被用于在蛋白 组学和药代动力学领域中分析蛋白（14)。本文所述的方法涉及利用该有力工具分析DNA聚 合酶。
[0056] 已经开发了用于完整分析这些的S Z05、Stoffel片段和GOLD (化学修饰的）形 式的方法。这些方法会提供快速地确定准确质量以及一些结构数据的能力。在SZ05的分 析中，数据证实了同一性，并且也表明，N-端甲硫氨酸和丙氨酸残基被切掉（图2)。GOLD DNA聚合酶的分析会提供以前不可得到的结构信息（图3)。通过用柠康酸酐可逆地修饰赖 氨酸残基，产生GOLD DNA聚合酶。在该工作之前，没有关于这些修饰的赖氨酸的程度或位 置的知识。使用被开发成保留热和酸不稳定的柠康酰基修饰的新方法，现在可能确定它们 在S Z05 GOLD中的总分布（图3)。该技术提供了更充分地表征这些分子和开始对它们的 制备、稳定性和贮存进行研究的工具。
[0057] 还已经开发了用于Z05 GOLD和Taq GOLD DNA聚合酶的肽测序的方法。该数据会 提供对这些分子做出的化学修饰的第一个详细图谱。分析揭示，各个赖氨酸残基的修饰程 度是在0-100%范围内，并且两种DNA聚合酶中的同源赖氨酸倾向于具有类似的修饰程度 (图5)。对比DNA聚合酶结构域中的修饰，揭示了 3个位置在Taq GOLD和Z05 GOLD中是 高度修饰的（在Taq中的K540、K663和K738)。在分子模型中分析这些位置，指示所有3个 位置都积极参与复制过程（图6)。在这些研究中揭示的详细信息证实了质谱法作为分析工 具的能力。在某些实施方案中，将质谱法用于分析处于它们的天然缓冲液和浓度的DNA聚 合酶。
[0058] 材料和方法 分析DNA聚合酶的能力涉及开发样品制备方法来除去干扰组分。例如，去污剂吐温20 与质谱法不相容，因为它具有干扰离子并且也可以造成离子抑制。该去污剂存在于所有的 酶贮存缓冲液和PCR主要混合物中，以帮助稳定化相当疏水的DNA聚合酶。理想地，样品制 备方法应当独立于缓冲液pH、DNA聚合酶浓度和DNA聚合酶大小（即完整的或经消化的）。 所述方法可以浓缩样品，具有高回收率，没有优先蛋白结合，和除去绝大部分的吐温20。这 样的方法可以普遍应用于在所有制剂（储备物、批料、主要混合物）中的所有DNA聚合酶和 完整蛋白或胰蛋白酶消化物。
[0059] 开发用于胰蛋白酶消化物的样品制备方法。
[0060] 胰蛋白酶反应物通常是非常稀的，具有酸性pH。已经推荐2种方法：（1)得自 Pierce的旋转柱，和（2)填充在吸管尖头中的强阳离子交换（SCX)树脂。首先，将吐温20 结合至支持物并使肽穿过。然后保留肽，随后洗涤以除去吐温20,然后洗脱肽。通过ELSD 定量在洗脱的肽中的残留吐温20。通过与未处理的对照消化物进行对比，确定蛋白回收率。 [0061 ] 开发用于肽绘图的LC-MS/MS方法。
[0062] 通过蛋白的过夜胰蛋白酶消化，随后在QTOFLCMS上分析，完成肽绘图。方法包括： 1)分离肽的色谱法方法，和2)鉴别质谱仪的源条件。这导致高序列覆盖度。串联MS的添 加可以用于验证肽序列并从而提高总序列数据的可靠性。串联MS的方法包括用于片段化 的离子（前体）的选择和将它有效地片段化的参数（碰撞能）的鉴别。
[0063] 开发用于GOLDDNA聚合酶的样品制备方法。
[0064] 将GOLD DNA聚合酶储存在高pH缓冲液中，以便保留酸和热不稳定的柠康酰基修 饰。用高pH缓冲液维持这些修饰的完整性是必要的。该pH远远超过DNA聚合酶pl，且因 而DNA聚合酶将具有使它们适合用于阴离子交换固相提取的负净电荷。已知DNA聚合酶在 pH 8不会保留在强阴离子交换（SAX)上。在10-11范围内的pH，评价完整的和消化的DNA 聚合酶的保留。通过ELSD来定量残余吐温20。通过完整DNA聚合酶的PAGE并通过与消化 物的未处理对照的LCMS谱进行对比，评价蛋白回收率。可替换地，评价高度浓缩的储备物 的沉淀的应用。这将通过与未沉淀的对照的LCMS谱进行对比来确定。在再悬浮的蛋白上 进行消化。
[0065] 开发与化学修饰的DNA聚合酶的胰蛋白酶消化相容的LC-MS/MS方法。
[0066] 分离胰蛋白酶消化的方法通常采用酸性缓冲液和高于环境温度的温度。以前使用 在20°C的碱性缓冲液运行，开发了用于这些分子的方法。由于在高pH时电离效率的下降， 这些方法比酸方法的灵敏度更低。尽管存在这些问题，序列覆盖图谱超过90%。串联MS的 添加可以用于澄清矛盾结果和验证肽序列以提高总序列数据的可靠性。
[0067] 研究柠康酰基修饰在再活化过程中的水解。
[0068] 以上方法的开发将使研究进入分子水平的再活化过程中。这些研究可以如下完 成：在PCR缓冲液中执行GOLD DNA聚合酶的部分再活化，确定得到的活性，和通过肽测序绘 制修饰图谱。
[0069] 在PCR主要混合物中的DNA聚合酶的鉴别和表征。
[0070] 这些方法意图充当支持工具来快速地证实DNA聚合酶身份和量。另外，它们可以 用于检测结构问题诸如裂解或氧化性损伤。
[0071] 开发用于PCR主要混合物的样品制备方法。
[0072] PCR主要混合物含有许多可能不利地影响在本文中开发的方法的回收率和/或效 率的组分。PCR主要混合物的样品制备具有维持或增加样品浓度至多40nM的额外要求。该 方案是在适当的代表性的PCR主要混合物中使用DNA聚合酶重复上述的方法开发过程。
[0073] 通过LCMS进行定性分析。
[0074] 主要混合物中的DNA聚合酶的浓度相对较低，这将导致在较高体积中注射较少样 品。如下评价在本文中开发的方法：1)确定检测限度（L0D)和2)研究增加样品体积的影 响。
[0075] 通过LCMS进行定量。
[0076] 通过开发参比标准，评价了定量DNA聚合酶的可行性。方案是评价Silva等（15) 报道的方法，该方法描述了一种从胰蛋白酶消化物进行绝对蛋白定量的方法。它们发现，在 MS信号应答和蛋白浓度之间存在关联。具体地，来自每摩尔蛋白的3个最强烈胰蛋白酶肽