-TOF MS)分析过程中，稳定修饰的pH允许修饰在该pH保留在聚合酶 上。在某些情况下，如本文中所述的二羧酸酸酐修饰在较低pH范围是不稳定的。因而，对 于这样的二羧酸酸酐修饰而言，8或以上的pH是稳定修饰的pH。
[0025] 当表示DNA聚合酶中的位置时，与另一个序列中的位置"对应"的氨基酸是基于根 据核苷酸或氨基酸位置数编号并且然后以最大化序列同一性百分比的方式比对序列的规 贝1J。"对应于[特定序列]的[X]位"的氨基酸是指与指定的序列的等同氨基酸比对的目的 多肽的氨基酸。通常，如本文中所述，对应于聚合酶的位置的氨基酸可以使用比对算法诸如 如下所述的BLAST来确定。因为不是给定的"对应区域"内的所有位置都需要是相同的，所 以对应区域内的非匹配位置可以被认为是"对应位置"。因此，如本文使用的，特定DNA聚合 酶的"对应于氨基酸位置[X]的氨基酸位置"是指，基于比对，在其它DNA聚合酶和结构同 源物和家族中的等效位置。
[0026] 对于序列比较，通常以一个序列作为参照序列，用测试序列与之比较。当使用序列 比较算法时，将试验和参照序列输入电脑，指定子序列坐标（coordinate)，如果必要，还指 定序列算法程序参数。通常使用默认程序参数，或者可以指定替代的参数。然后序列比较 算法基于程序参数计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性或相似性。
[0027] 如本文使用的，"比较窗口"包括涉及选自20-600,通常约50-约200,更通常约 100-约150的任一数量的连续位置的区段，其中在两个序列最佳比对后可以将序列与相 同数量的连续位置的参照序列比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。可以， 例如，通过Smith和Waterman的局部同源性算法2:482，1970)，通过 Needleman 和 Wunsch 的同源性比对算法 C/；#c^.i?ic^.48:443，1970)，通过 Pearson 和 Lipman的搜索相似性法85:2444，1988)，通过这些算法的计 算机化执行（例如，the Wisconsin Genetics Software Package 中的 GAP, BESTFIT, FASTA,和 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, Wis.)，或 者通过手工比对和目测检查（参见，例如，Ausubel爭，i/? ifoJeci/Jar 汾Wo# (1995增刊））实施用于比较的最佳序列比对。
[0028] 适合用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的例子是BLAST和BLAST 2. 0 算法，其分别由 Altschul 等（TVi/diofe Tfes. 25:3389-402，1977)和 Altschul 等 C/； 价〇2 215:403-10，1990)描述。用于执行BLAST分析的软件可通过国立生物技术信 息中心（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)公开地获得。该算法涉及：首先通过在查询序列 中鉴别长度W的短字段来鉴别高评分序列对（HSPs)，其在与数据库序列中相同长度字段比 对时匹配或满足一些阳性值得阈值评分T。T被称作是邻近字段评分阈值（上述Altschul 等）。这些最初的邻近字段命中作为起始搜索的种子以发现包含它们的更长HSPs。字段命 中沿着各序列双向延伸，只要累计的比对评分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M( - 对匹配残基的奖分；始终大于0)和N(错配残基的罚分；始终小于0)来计算累计评分。对 于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累计评分。字段命中在各方向的延伸停止于：累计比对 评分从它最大获得值降低数量X时；由于一个或更多个负分残基比对的累积，累计分数达 到或低于0时；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和 速度。BLASTN程序（用于核苷酸序列）使用字长（W)ll，期望值（E)10, M=5, N=-4作为默 认值，并比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3,期望值（E) 10,和BL0SUM62 评分矩阵（参见 Henikoff 和 Henikoff, /^roc.他以 jcad "似 89:10915，1989)比对 (B) 50,期望值（E) 10, M=5, N=-4作为默认值，并比较两条链。
[0029] BLAST算法也执行两个序列之间相似性的统计分析（参见，例如，Karl in和 Altschul, 90:5873-87，1993)。BLAST 算法提供的一种相似性 的量度是最小总和概率（P((N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间匹配偶然发生的概 率的指标。例如，如果在测试核酸与参照核酸的比较中最小总和概率低于约〇. 2,典型地低 于约0. 01，以及更典型地低于约0. 001，那么该核酸被认为与参照序列是相似的。
[0030] II.检测DNA聚合酶中的化学修饰的方法 提供了检测DNA聚合酶中的化学修饰（例如赖氨酸修饰）的量和/或位置和量的方 法。在某些实施方案中，修饰的特性和量可用于监测和控制热稳定的DNA聚合酶在酶的生 产、贮存和使用过程中的特性。此外，所述方法可用于表征新设计的灭活DNA聚合酶的化学 修饰。
[0031 ] 在一个方面，提供了检测赖氨酸修饰的DNA聚合酶中的共价赖氨酸修饰的数目的 方法。但是，应当指出，本文所述的方法可以用于评估聚合酶或其它蛋白的其它化学修饰， 只要聚合酶或其它蛋白中的修饰的可能位点以及修饰的质量是可预测的。在某些实施方 案中，所述方法包括，（i)在稳定修饰的pH检测赖氨酸修饰的DNA聚合酶的质量和（ii)通 过将赖氨酸修饰的DNA聚合酶的质量与不含赖氨酸修饰的聚合酶进行对比，计算赖氨酸修 饰的DNA聚合酶中的赖氨酸修饰的数目，其中所述赖氨酸修饰的数目是所述赖氨酸修饰的 DNA聚合酶的质量与所述不含赖氨酸修饰的聚合酶之差除以所述赖氨酸修饰的质量，由此 检测所述DNA聚合酶中的赖氨酸修饰的数目。
[0032] 如上所述，将化学修饰的热稳定的DNA聚合酶(诸如赖氨酸修饰的DNA聚合酶）用 在需要高特异性（减少的非特异性的产物扩增）和增加的灵敏度和收率（低模板DNA浓度） 的PCR应用（例如热启动PCR)中。化学修饰的热稳定的DNA聚合酶在低于或等于引物退火 温度的温度是基本上无活性的。因而，化学修饰的DNA聚合酶在非严谨条件下是无活性的， 并将由非故意引发造成的不希望的延伸产物的合成阻止或降低至不显著的水平。在热活化 步骤中，从聚合酶除去化学修饰，由此再生活性酶和开始PCR扩增。热活化步骤通常发生在 远高于引物退火温度的温度。商购可得的化学修饰的或可逆灭活的热稳定的DNA聚合酶的 非限制性例子包括 Ampli Taq GoIcTDNA 聚合酶、FastStart?Taq DNA 聚合酶、HotStar?Taq DNA 聚合酶、Cheetah?Taq DNA 聚合酶和 Maxima Hot Start?Taq〇
[0033] 在可逆地灭活的DNA聚合酶中，赖氨酸残基的e -氨基的化学修饰可以可逆地封 闭赖氨酸残基。蛋白的活性区域中的赖氨酸的修饰然后导致蛋白的灭活。另外，在活性区 域之外的赖氨酸的修饰可以通过空间相互作用或构象变化而促进蛋白的灭活。已经描述了 许多化合物，其与蛋白的氨基反应，由此可逆地修饰它们。例如，已经如下可逆地修饰氨基： 三氣乙酰化（参见 Goldberger 和 Anfinsen, I%2，1:410)，脒化（参见 Hunter 和 Ludwig, 1962，J 办zer. CAev??. 5bc. 84:3491)，马来酰化（参见 Butler 爭， 1967，SiocAev??. J 103:78)，乙酰乙酰化（参见Marzotto 爭，1967， Res.Coirnun.26:517 ;和 Marzotto 爭，1968，SiocAia?. 154:450)，四氣 琥I白酰化（参见 Braunitzer 爭，1968，CAe?. 349:265)， 和朽1康醜化（参见 Dixon 和 Perham, 1968，i^iocAe?. J 109:312-314;和 Habeeb 和 Atassi, 1970,Biochemistry9(25):4939-4944)〇
[0034] 此外，美国专利号5, 773, 258和美国专利号5,677, 152公开了通过使修饰试剂 (例如二羧酸酸酐）与聚合酶的赖氨酸氨基反应而可逆地灭活热稳定的DNA聚合酶的方 法。因而，在某些实施方案中，通过DNA聚合酶与修饰试剂的反应，形成共价赖氨酸修饰。 在某些其它实施方案中，修饰试剂是二羧酸酸酐。可用于可逆地灭活DNA聚合酶的二羧酸 酸酐的非限制性例子包括：马来酸酐；被取代的马来酸酐诸如柠康酸酐、顺式-乌头酸酐和 2, 3-二甲基马来酸酐；外-顺式-3, 6-桥氧-A 4-四氢邻苯二甲酸酐；和3, 4, 5, 6-四氢邻 苯二甲酸酐。因而，在某些实施方案中，所述二羧酸酸酐选自马来酸酐、柠康酸酐、顺式-乌 头酸酐、2, 3-二甲基马来酸酐、外-顺式-3, 6-桥氧-A 4-四氢邻苯二甲酸酐和3, 4, 5, 6-四 氢邻苯二甲酸酐。在某些实施方案中，所述共价赖氨酸修饰是柠康酰基修饰。在其它实施 方案中，所述共价赖氨酸修饰是乌头酰化的修饰。在某些实施方案中，所述共价赖氨酸修饰 是2, 3-二甲基马来酰化的修饰。本发明的方法不限于举例说明的酸酐，但是可以应用于能 够可逆地灭活DNA聚合酶且可以通过质谱法检测出的任何化学氨基酸修饰。本文提供的方 法可以用于检测在DNA聚合酶中的化学修饰（例如赖氨酸修饰）的位置、以及在DNA聚合 酶中的化学修饰（赖氨酸修饰）的程度。在使用本文(包括其实施方案）提供的方法检测 DNA聚合酶中的化学修饰的情况下，所述化学修饰对于每种检测的修饰残基而言是相同的。 例如，在将DNA聚合酶柠康酰化的情况下，本文提供的方法会检测存在于DNA聚合酶中的柠 康酰化的残基，而在将DNA聚合酶乌头酰化的情况下，所述方法会检测乌头酰化的残基。
[0035] 在本文(包括其实施方案)提供的方法中，使用质谱法检测DNA聚合酶的化学修饰。 在某些实施方案中，质量检测可以包括四极飞行时间（Q-T0F)液相色谱法质谱法（LCMS)。 Q-T0F/LCMS将液相色谱法的物理分离能力与质谱法的质量分析能力组合。使用液相色谱 法（LC)，包括化学修饰的DNA聚合酶的样品组分被柱分离，这取决于它们的极性。一般而 言，极性越小和组分越大，它们在柱中移动得越慢。这些分离技术可以以离线或在线方式执 行。以在线方式执行分离技术，样品在穿过柱以后被直接转移至质谱仪，且样品的不同组分 随着从柱洗脱(在时间上分布）而得到分析。以离线方式执行分离技术，首先将样品用柱分 离，并将不同