一种预测非甾体抗炎药类新型污染物对斑马鱼早期生活阶段胚胎毒性的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于环境毒理学技术领域，具体涉及一种预测非留体抗炎药类新型污染物对斑马鱼早期生活阶段胚胎毒性的方法。
【背景技术】
[0002]广泛使用的非留体抗炎药(NSAIDs)在为人类减轻病痛的同时，也带来诸多环境污染和危害，较低浓度暴露即会对水生生物造成不良影响，而且还可能通过协同、相加等相互作用导致大量混存时的联合毒性增强，潜在风险不容忽视。然而，目前有关非留体抗炎药的毒理研究仍主要集中在实验室内模拟的短期高剂量暴露下的急性毒性方面，对其实际环境水平暴露时所可能引起的毒性则研究较少，但非留体抗炎药的急性毒性数据往往远高于其实际检出浓度(100-1000倍)，并且其在水体中通常是大量多种混存、共同作用，情况较为复杂，因此，为了避免高估甚至低估非留体抗炎药的毒害风险，提高准确度和有效性，应重点加强对这类污染物的低剂量慢性毒性研究以及对更敏感生物体、生物体早期更敏感生活阶段的致毒作用和潜在风险研究。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是针对现有技术中常规理化指标不能反映实际环境中低剂量非甾体抗炎药类新型污染物的毒性的问题，提供一种预测非留体抗炎药类新型污染物对斑马鱼早期生活阶段胚胎毒性的方法，从而实现对非留体抗炎药类新型污染物的毒性特征和毒性水平进行分析测试和定量描述。
[0004]本发明的预测非留体抗炎药类新型污染物对斑马鱼早期生活阶段胚胎毒性的方法，包括以下步骤:
[0005]a.将待测的非留体抗炎药类新型污染物配制成呈等对数间距浓度的试验溶液，将斑马鱼胚胎暴露于试验溶液中半静态培养；
[0006]b.记录暴露7天后斑马鱼胚胎的死亡率和畸变率；
[0007]c.根据步骤b得到的数据计算得到对应的LC5。和致畸EC 50o
[0008]所述的步骤a的斑马鱼胚胎为受精后不超过Sh的斑马鱼胚胎。
[0009]所述的步骤a的斑马鱼胚胎暴露于试验溶液中半静态培养，是在温度为25±1°C、光照周期为14h光照:1h黑暗条件下培养，在暴露开始第二天每隔24h更换原试验溶液体积3/4的新鲜试验溶液。
[0010]所述的步骤b的死亡率，死亡情况判断标准包括:静止不动、无呼吸运动、无心脏跳动、中枢神经系统呈白色不透明或/和对机械刺激无任何反应。
[0011]所述的步骤b的畸变率，畸变类型判断标准包括:卵凝结、发育停滞、心包囊肿、卵黄囊肿、脊柱弯曲或/和尾部畸变(尾折)。
[0012]本发明方法采用斑马鱼早期生活阶段胚胎的体内试验方法，来测定评估非甾体抗炎药类新型污染物对斑马鱼胚胎的毒性作用，判断这类污染物对斑马鱼及其胚胎是否具有毒性的依据为:
[0013]1、利用半静态实验方式，测定得到非留体抗炎药类新型污染物在不同浓度水平不同暴露时间内对斑马鱼及其胚胎的毒性效应，具体包括致畸(卵凝结、发育停滞、心包囊月中、卵黄囊肿、脊柱弯曲或/和尾部畸变(尾折))和致死效应，并通过计算半致死性浓度(50% Lethal concentrat1n, LC50)和半数致畸效应浓度(50% Effect concentrat1n,EC5。)来对毒性进行描述与表征；
[0014]2、参照欧盟委员会所划分的污染物对于水生生物的风险等级(EU Directive93/67/EEC，1996):EC50<lmg/L 表示非常有毒;lmg/L〈EC50〈10mg/L 表示有毒；llmg/L<EC50<100mg/L表示有害)进一步对比评估非留体抗炎药类新型污染物对斑马鱼及其胚胎的致毒级别，并推测这类污染物在低水平暴露环境下因生物累积和生物放大等效应所可能导致的对水生生物的毒害作用及生态安全风险。
[0015]本发明方法可以对非留体抗炎药类新型污染物的毒性特征和毒性水平进行分析测试和定量描述，解决常规理化指标不能反映的典型非留体抗炎药污水生物毒性，同时可作为非留体抗炎药污水生物毒性监测和评价的指标，可为水体中这类污染物的潜在生态毒性风险预测与评估提供参考。
【附图说明】
[0016]图1是经双氯芬酸染毒后的斑马鱼胚胎非致死性效应。其中，A是尾部畸变(尾折)，B是脊柱弯曲，C是卵黄囊肿，D是心包囊肿。
[0017]图2是经双氯芬酸染毒后的斑马鱼胚胎致死性效应。其中，A是胚胎死亡，B是幼鱼死亡。
【具体实施方式】
[0018]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0019]下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。
[0020]实施例1:三种典型非留体抗炎药类新型污染物(双氯芬酸、醋氨酚和布洛芬)对斑马鱼早期生活阶段胚胎毒性效应评估
[0021](I)预试验
[0022]实验前先挑选活泼健康的短尾斑马鱼雌雄成鱼(I: I)放入曝气24h后的自来水水槽中，保持水槽温度26 ± I °C左右。为了防止鱼自食其卵，放纱网于水槽中，然后盖上纸箱避光。并于次日早晨捞出亲鱼，用虹吸的方法收集胚胎于大烧杯中。在解剖显微镜下挑选正常发育、形态完好的胚胎；分裂正常的胚胎不粘沉并且呈现透明，未受精胚胎粘沉呈乳白色，未受精胚胎不分裂或者分裂形状明显不规则(不均衡或水肿)或卵膜坏损或者黑色。
[0023]毒性效应评估实验开展前先进行预实验以确定双氯芬酸、醋氨酚和布洛芬三种目标化合物对斑马鱼胚胎的全致死和全存活浓度范围(加标组5浓度2水平)，具体设置为:双氯芬酸暴露浓度0.30、1.20,4.80、19.2,76.8mg/L ;醋氨酚暴露浓度0.05,0.20,0.80、3.20、12.8mg/L ;布洛芬暴露浓度0.20,0.80,3.20、12.8,51.2mg/L。此外，实验开始前会先繁殖斑马鱼数次，以便观察正常胚胎发育并统计胚胎的孵化率，胚胎孵化率达到90%以上方可进行实验。胚胎暴露实验在恒温光照培养箱中进行，保持温度为25土1°C左右，光照周期为14h光照:1h黑暗。选用玻璃平板(9cm培养皿)作为染毒实验容器，加入20mL试验试液和12枚胚胎。采用半静态法，即在实验开始第二天每隔24h更换新鲜同等浓度溶液，更换体积可达容器容量的1/2。胚胎连续暴露7天，每隔24h进行观察和数据统计，并及时更换新鲜同等浓度溶液。每次所更换的实验溶液均由同一母液现配得到。在倒置显微镜下观察并记录斑马鱼胚胎暴露24、48、7