一种胸腔积液中挥发性有机物的分析方法
【专利说明】-种胸腔积液中挥发性有机物的分析方法 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种胸腔积液中挥发性有机物的分析方法，具体设及通过基于顶空固 相微萃取技术化S-SPM巧结合冷阱聚焦-气相色谱质谱（GC/M巧联用的方法快速准确地分 析胸腔积液中的挥发性有机物。 (二）【背景技术】
[0002] 胸腔积液（PleuralEfTusion)是肺部疾病最为特异的人体体液，是机体内多种疾 病在胸膜上的反映，主要由肺部病变直接产生，与疾病发展关系密切。正常人胸膜腔内也有 少量的液体，在呼吸运动时起润滑作用，一般正常人每24小时有500~lOOOmL的液体形成 与吸收。胸膜腔内液体自毛细血管的静脉端再吸收，其余的液体由淋己系统回收至血液，滤 过与吸收处于动态平衡。若由于局部病变破坏了此种动态平衡，致使胸膜腔内液体形成过 快或吸收过缓，临床上就产生了胸腔积液。根据发病原因，胸腔积液一般可分为良性和恶性 胸腔积液。恶性胸腔积液是肿瘤患者特别是肺癌患者常见的临床问题，良恶性胸腔积液的 诊断和治疗一直是困扰临床医生的一大难题。
[0003] 目前临床应用的胸腔积液肿瘤标志物主要是基因表达产物和蛋白类物质，而对挥 发性有机物鲜有报道。基因表达产物、蛋白类物质检测手段有高效液相色谱质谱法、核磁共 振、电泳等方法，而挥发性有机物主要W气相色谱质谱为主。本发明建立了一种能较全面反 映胸腔积液中的小分子挥发性有机物的HS-SPME-冷阱聚焦-GC/MS法，同时对各挥发性有 机物进行定性和半定量分析，比较其在肺癌和肺部良性疾病患者胸腔积液中的差异性，对 筛选出潜在的肺癌标志物及辨别良恶性胸腔积液具有重要的参考意义和实际应用价值。 (H)
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种新颖的顶空固相微萃取化S-SPME)-冷阱聚焦-气相色 谱质谱（GC/M巧联用对胸腔积液中的挥发性有机物进行定性、半定量分析的方法，在此基 础上对各物质在良恶性胸腔积液中存在与否及含量高低进行比较，从而评价它们在良恶性 胸腔积液甚至肺癌患者胸腔积液的诊断中的价值，W及是否有作为特异性和灵敏度更高的 肿瘤标志物的潜能。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] -种胸腔积液中挥发性有机物的顶空固相微萃取-冷阱聚焦-气相色谱质谱联用 的分析方法，所述的分析方法为：将胸腔积液样品、氯化钢固体、揽拌磁子加入具有聚四氣 乙締膜隔垫的顶空瓶中，在40~60°C、500~900rmp揽拌下，用CAR/PDMS纤维的萃取头进 行顶空固相微萃取，萃取15~30min后，迅速将萃取头插入气相色谱进样口解析，此时气相 色谱柱靠近柱头的部分浸泡在盛有液氮的容器中形成冷阱聚焦，解析2~5min后，将气相 色谱柱靠近柱头的部分从盛有液氮的容器中取出，同时将萃取头从气相色谱进样口取出， 启动气相程序进行GC/MS检测分析，气相色谱质谱联用仪的工作条件为：
[0007] 气相色谱条件为泡谱柱为弱极性柱，选用UA-5金属毛细管柱，规格30mX0. 25mm i.d.X0.25i^m膜厚，5%苯基甲基聚硅氧烷；柱箱：初溫35°C，保持3~10min，W5~ 10°C/min速率升到80~120°C，再W10~15°C/min速率升到220~250°C;进样口溫度 为230°C~300°C;进样方式采用前0. 1~1.Omin不分流进样；载气为氮气，流速1. 0血/ min；
[0008]质谱条件为：电子轰击离子源，电离能量为70eV，离子源溫度200~250°C，传输线 溫度210~250°C，离子扫描范围40~550m/z;
[0009] 分析过程得到胸腔积液样品的总离子流图和质谱图，所得总离子流图中每一个峰 代表胸腔积液样品的一个挥发性有机物组分，并且每一个峰各自得到相应的质谱图，通过 Nist2. 0质谱标准谱库检索每一个峰对应的质谱图对胸腔积液中的挥发性有机物进行定 性分析，根据总离子流图中每一个峰的峰强度，通过计算峰面积对胸腔积液中的挥发性有 机物进行半定量分析，从而得到胸腔积液中挥发性有机物的分析结果。
[0010] 本发明所述胸腔积液均采用胸腔穿刺术采集，用内置医用冰袋的密封保溫盒将采 集的胸腔积液储存于-20°c冰箱中，分析前取出解冻，离屯、并快速取上清液制成胸腔积液样 品。
[0011] 本发明分析方法中，所述氯化钢固体的用量为在胸腔积液样品中达到饱和的量。
[0012] 优选所述气相色谱条件为：色谱柱为弱极性柱，选用UA-5金属毛细管柱，规格 30mX0. 25mmi.d.X0. 25ym膜厚，5%苯基甲基聚硅氧烷；柱箱：初溫35°C，保持3min，W 5°C/min速率升到80°C，再Wl〇°C/min速率升到230°C;进样口溫度为250°C;进样方式采 用前0. 7min不分流进样；载气为高纯氮气巧9. 99% )，流速1. 0血/min。
[0013]优选所述质谱条件为：电子轰击离子源巧I)，电离能量70eV，离子源溫度210°C， 传输线溫度230°C，离子扫描范围40~500m/z。
[0014] 本发明通过将气相色谱柱靠近柱头的部分浸入盛有液氮的不诱钢杯中形成冷阱 聚焦，从而成功分离出高挥发性的有机物，提高了分析灵敏度，改善了谱带展宽问题；具体 的，所述气相色谱柱靠近柱头的部分为：距离柱头10~30cm长度处的一段5~15cm长度 的柱范围。
[0015] 本发明分析方法检测并定性出胸腔积液中的65种匹配度较高的挥发性有机物， 得到其检出频率及各物质类别的平均峰面积，分析比较了肺癌和良性疾病患者胸腔积液中 挥发性有机物的差异。
[0016] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：顶空固相微萃取集萃取、富集及 进样于一体，操作简便，无需复杂的前处理过程，消除了生物样品复杂的基质干扰，又不造 成样本中组分信息的失真；冷阱聚焦技术使胸腔积液中高挥发性的有机物在低溫下冷凝和 二次解析，并在合适的色谱条件下得到有效的分离；该方法能够快速检测胸腔积液中的挥 发性有机物，并进行定性和半定量分析，再运用差异性分析对良恶性胸腔积液的辨别甚至 肺癌标志物的筛选有着十分重要的意义。 (四）【附图说明】
[0017]图1为胸腔积液在使用液氮冷阱聚焦前（a)、后化）的气相色谱质谱图；
[0018] 图2为不同程序升溫条件下胸腔积液的气相色谱质谱图；
[0019] 图3为S次平行测定得到的胸腔积液中挥发性有机物的服-SPME-冷阱聚焦-GC/ MS总离子流图；
[0020] 图4为肺癌（a,b)和结核性胸膜炎（c，d)患者胸腔积液中挥发性有机物的 服-SPME-冷阱聚焦-GC/MS总离子流图；
[0021] 图5为28例良恶性胸腔积液中各化学类别物质的平均峰面积柱状图；
[0022] 图6为21个高检出率有机物在癌症组和炎症组的平均峰面积柱状图；
[0023] 图7a~7g为差异较大的7种有机物的平均峰面积分布箱形图。 (五）【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于 此。
[00巧]分析样品：胸腔积液样品均由浙江省人民医院呼吸内科采用胸腔穿刺术采集。实 验人员用内置医用冰袋的密封保溫盒将样品取回，储存于-20°C冰箱中待用。分析前，将胸 腔积液样品从-20°C的冰箱中取出，置于室溫下解冻。解冻完毕，将样品管置于3000rmp的 离屯、机中离屯、lOmin，移取上层清液ImL于15mL预先放置磁力揽拌子且具有聚四氣乙締膜 隔垫的顶空瓶中，并称取〇.38g化C1固体加入样品中，制成待测胸腔积液样品。所有肺癌 患者均为组织病理学确认的初诊患者。
[0026] 分析装置：美国lliermoFinniganTraceDSQ的气相色谱/质谱联用仪（GCHVB); 美国Supleco公司57330U型手动进样SPME手柄及CAR/PDMS萃取纤维。
[0027] 实施例1出S-SPME-冷阱聚焦-GC/MS方法对胸腔积液样品的分析
[002引 （1)实验方法
[0029] 将上述装有待测胸腔积液样品的顶空瓶置于磁力揽拌器上，中速揽拌（SOOrmp) 并加热至50°C，平衡3min后将75ymCAR/PDMS纤维的萃取头伸出不诱钢保护针管，暴露于 胸腔积液的上空，萃取20min后将萃取头缩回针管，迅速将针管完全插入气相色谱的气化 室内并推出萃取头，利用气化室的高溫进行解析。期间，气相色谱柱距离柱头20cm长度的 一段10cm长度的柱范围浸入盛有液氮的不诱钢杯中形成冷阱聚焦，气相进样口分流阀关 闭。待解析3min后，移除盛有液氮的不诱钢杯，同时将萃取头从气相色谱气化室取出，启动 气相程序进行GC/MS检测分析。
[0030] 气相色谱条件为：进样口溫度250°C，载气为高纯化巧9. 99% )，流速1. 0血/min， 前0. 7min不分流进样。色谱柱溫度采用程序升溫方式：初始溫度为35°C，保持3min，W 5°C/min的速度升溫到80°C，再Wl〇°C/min的速度升溫到230°C。
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