1例，肺脈肿1例。
[0054] (1)各有机物平均峰面积分析
[00巧]在定量分析及差异性物质筛选过程中，偶然出现的物质没有统计学意义，并会对 结果产生一定的误差。所W，针对选用的18例样本的定性结果，筛选出检测率和匹配度较 高的21种有机物，进行平均峰面积的比较分析。图6为21个有机物在癌症组和炎症组的 平均峰面积柱状图（a原图；b放大60倍）。由图（a)可知，本法检测到的胸腔积液中峰强 度较大的挥发性有机物有7种，即丙酬、二氯甲烧、乙酸乙醋、甲苯、环己醇、环己酬和2-乙 基-1-己醇。其中，甲苯、丙酬均有报道认为是潜在的肺癌标志物，但是两者在选取的肺癌 和肺部炎症胸腔积液样本中的平均峰面积比较接近，差异并不明显。乙酸乙醋、环己醇、环 己酬和2-乙基-1-己醇运四种有机物则存在较大的差异，当然，运四种物质是否真正存在 差异性表达还需要进一步作大样本的分析。
[0056] 由图化）所示，将柱状放大60倍后可W发现，除了上述7种峰强度较大的有机物 夕F，其他有机物虽然强度较低，但也显示差异性趋势，比如环戊烧、=氯甲烧、正庚烧、辛烧、 乙基苯和二甲基苯等在癌症组中检测到较高的含量，而乙醇、乙醒、2-甲基戊烧，3-甲基戊 烧则在炎症组中有更高的表达。
[0057] (2)差异性有机物的箱形图分析
[0058] 前面通过峰面积均值大小的比较初步认为胸腔积液中检测到的7种挥发性有机 物（丙酬、二氯甲烧、乙酸乙醋、甲苯、环己醇、环己酬和2-乙基-1-己醇）强度较高，对肺 癌及肺部良性疾病患者的鉴别可能存在一定的价值。为了更好地比较肺癌组和炎症组样品 中该7种有机物的含量分布及差异，分别将其绘制成箱形图，如图7a~7g所示。
[0059] 箱形图度ox-plot)是一种用来表示数据集的位置分布和变异情况的统计图，特 别是用于发现和表示不同数据的位置与变化，直观明了地识别数据集中的异常值。虽然我 们的假设检验W均值为基础，但是箱形图提供的并不是均值，而是中位数信息。箱形图用 6个数据节点对数据集做了简单的总结，运6个点包括第一四分位数怕1)、第二四分位数 怕2)、第=四分位数怕3)，上边缘、下边缘和异常值。Q1指单组样本中所有数值从小到大排 列后位于25%的数值，Q2即中位数，指单组样本中所有数值从小到大排列后位于50%的数 值，Q3指单组样本中所有数值从小到大排列后位于75%的数值。Q1到Q3的长度为一个四 分间距。上边缘是指Q3到距离Q3 1.5倍四分间距内出现的最大值，下边缘是指Q1到距离 Q1 1. 5倍四分间距内出现的最小值。超过箱边缘但距离边缘小于3个四分间距的点称为异 常值，距离箱边缘大于3个四分间距的点称为极端异常值。箱形图分析没有对数据作任何 限制性要求，它只是真实直观地表现数据形状的本来面貌。
[0060] 图7a~7g为运7种有机物的平均峰面积分布箱形图【（a)丙酬，化）甲苯，（C)二 氯甲烧，（d)乙酸乙醋，（e)环己醇，讯2-乙基-1-己醇，（g)环己酬】。虽然就平均峰面积 而言，肺癌组的丙酬峰强度比炎症组的略高，但是箱形图显示炎症组的丙酬总体分布上却 比肺癌组的略大。主要原因是肺癌组中丙酬的含量分布比较均匀，而炎症组中虽然大多数 样本中的丙酬含量比肺癌组的低，但是也存在小部分高含量的样本，度量分布比较分散。相 同地，虽然肺癌组的甲苯峰面积总体分布比炎症组中的大，但是其分布比较分散，中位数的 值比炎症组中的小很多。所W丙酬和甲苯在肺癌和炎症胸腔积液间的差异并不显著，不能 明确地指出其在两组胸腔积液中含量大小，需要更大的样本量来判别其分布趋势W及差异 度。而二氯甲烧和乙酸乙醋的差异性则比较显著，炎症组的含量均保持在肺癌组的中位数 水平之下，总体分布明显低于肺癌组。环己醇在炎症组中的检出率为22. 2%，箱形图分布中 将该两个数值作极端异常值处理，故无法形成箱形。因此，肺癌组的环己醇更加具有差异性 有机物的价值。2-乙基-1-己醇是前期服-SPME-GC/MS研究中认为的潜在肺癌标志物之 一，在本研究选取的样本中同样存在一定差异的，但是差异性有所减轻且分布严重偏态，运 表明样本的不同可能会影响差异性结果的分析，所W2-乙基-1-己醇是否能作为肺癌标志 物及其灵敏度的研究仍然需要更多更长期的跟踪验证。环己酬是7个有机物中差异性最明 显的物质，炎症组中环己酬的峰面积要远远小于肺癌组中检测到的环己酬的峰面积，而运 一结果与课题组前期研究的结论相一致。值得注意的是，该箱形图分析所判别的极端异常 值，普遍存在于肺癌组的某两个样本中，而炎症组则设及5个样本之多，运也说明炎症组组 间差异性的干扰比较大，运可能与病因的多样性有关。
[0061] 不同于均值分析，箱形图分析更加具象地表现了该7种有机物数据分布情况，排 除了异常值的干扰。在此基础上，初步认为二氯甲烧、乙酸乙醋、环己醇、环己酬和2-乙 基-1-己醇运5种有机物在两组间有较大的差异性，有鉴别肺癌和炎症性胸腔积液的潜能。
【主权项】
1. 一种胸腔积液中挥发性有机物的顶空固相微萃取-冷阱聚焦-气相色谱质谱联用 的分析方法，其特征在于，所述的分析方法为：将胸腔积液样品、氯化钠固体、搅拌磁子加入 具有聚四氟乙烯膜隔垫的顶空瓶中，在40~60°C、500~900rmp搅拌下，用CAR/PDMS纤 维的萃取头进行顶空固相微萃取，萃取15~30min后，迅速将萃取头插入气相色谱进样口 解析，此时气相色谱柱靠近柱头的部分浸泡在盛有液氮的容器中形成冷阱聚焦，解析2~ 5min后，将气相色谱柱靠近柱头的部分从盛有液氮的容器中取出，同时将萃取头从气相色 谱进样口取出，启动气相程序进行GC/MS检测分析，气相色谱质谱联用仪的工作条件为： 气相色谱条件为：色谱柱为弱极性柱，选用UA-5金属毛细管柱，规格30mX0. 25mmi. d. X0. 25 ym膜厚，5%苯基甲基聚硅氧烷；柱箱：初温35°C，保持3~lOmin，以5~10°C / min速率升到80~120°C，再以10~15°C /min速率升到220~250°C ;进样口温度为 230°C~300°C ;进样方式采用前0. 1~1.0 min不分流进样；载气为氦气，流速1.0 mL/min ; 质谱条件为：电子轰击离子源，电离能量为70eV，离子源温度200~250°C，传输线温度 210~250°C，离子扫描范围40~550m/z ; 分析过程得到胸腔积液样品的总离子流图和质谱图，所得总离子流图中每一个峰代表 胸腔积液样品的一个挥发性有机物组分，并且每一个峰各自得到相应的质谱图，通过Nist 2. 0质谱标准谱库检索每一个峰对应的质谱图对胸腔积液中的挥发性有机物进行定性分 析，根据总离子流图中每一个峰的峰强度，通过计算峰面积对胸腔积液中的挥发性有机物 进行半定量分析，从而得到胸腔积液中挥发性有机物的分析结果。2. 如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述胸腔积液采用胸腔穿刺术采集，用 内置医用冰袋的密封保温盒将采集的胸腔积液储存于_20°C冰箱中，分析前取出解冻，离心 并快速取上清液制成胸腔积液样品。3. 如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述氯化钠固体的用量为在胸腔积液 样品中达到饱和的量。4. 如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述气相色谱条件为：色谱柱为弱极性 柱，选用UA-5金属毛细管柱，规格30mX0. 25mm i.d. X0. 25ym膜厚，5%苯基甲基聚硅氧 烷；柱箱：初温35°C，保持3min，以5°C /min速率升到80°C，再以10°C /min速率升到230°C; 进样口温度为250°C ;进样方式采用前0. 7min不分流进样；载气为99. 99%高纯氦气，流速 1.0 mL/min〇5. 如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述质谱条件为：电子轰击离子源，电 离能量70eV，离子源温度210°C，传输线温度230°C，离子扫描范围40~500m/z。6. 如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述盛有液氮的容器为不锈钢杯。7. 如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述气相色谱柱靠近柱头的部分为：距 离柱头10~30cm长度处的一段5~15cm长度的柱范围。
【专利摘要】本发明提供了一种胸腔积液中挥发性有机物的顶空固相微萃取-冷阱聚焦-气相色谱质谱联用的分析方法，通过基于顶空固相微萃取技术结合冷阱聚焦-气相色谱质谱联用的方法快速准确地分析胸腔积液中的挥发性有机物；本发明中，顶空固相微萃取集萃取、富集及进样于一体，操作简便，无需复杂的前处理过程，消除了生物样品复杂的基质干扰，又不造成样本中组分信息的失真；冷阱聚焦技术使胸腔积液中高挥发性的有机物在低温下冷凝和二次解析，并在合适的色谱条件下得到有效的分离；本发明方法能够快速检测胸腔积液中的挥发性有机物，并进行定性和半定量分析，再运用差异性分析对良恶性胸腔积液的辨别甚至肺癌标志物的筛选有着十分重要的意义。
【IPC分类】G01N30/88
【公开号】CN105116085
【申请号】CN201510486512
【发明人】王丽丽, 张洁, 张佩佩, 刘会君, 黄忠平, 潘再法
【申请人】浙江工业大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月10日