31] 质谱条件为：电子轰击巧I)离子源，电离电压70eV，传输线溫度230°C，离子源溫 度210°C，全扫描质量范围40~500m/z，溶济延迟时间为Omin。
[0032] (2)分析方法的建立
[0033]a、冷阱聚焦方法的建立
[0034]为了消除不分流进样引起的谱带展宽，提高低沸点有机物的分离，研究中常常需 要用液氮或干冰作冷阱，将挥发性组分二次凝集在前端毛细管中。冷阱低溫吸附并瞬间 升溫解吸，降低了系统误差，提高了分析的灵敏度，改善了谱带展宽问题。基于冷阱聚焦理 念，目前已衍生出许多商品化的冷进样系统，其中最著名的是CIS冷进样口（Gerstel，德 国）。但是此类设备价格昂贵，一般多与自带的前处理技术联用。因此，针对本实验研究所 遇到的问题，实验中采用了一种自制的液氮冷阱聚焦装置（Self-madeCooledInjection System,SCIS)，将毛细管柱靠近柱头一段浸入液氮冷冻，从而把目标组分集中在柱头，大大 提高了毛细管柱的分离能力。运种简易的冷阱聚焦操作通用性强，较灵活，成本低，适用于 实验室的科研工作。
[0035]服-SPME萃取得到的胸腔积液中挥发性有机物在进样口的高溫环境下进行热解 析，在载气的带动下，所有的物质均进入色谱柱柱头，然后在液氮低溫作用下进行二次冷凝 富集。随后，移去液氮装置，启动气相色谱开始程序升溫，使柱头的有机物在色谱柱中得到 分离。为了考察该冷阱聚焦技术对实际样品分析的效果，选取一结核性胸膜炎患者（男，24 岁）的胸腔积液样品进行实验，与普通的HS-SPME-GC/MS方法进行比较，得到图1所示结 果。从图中可W明显的发现，普通的服-SPME-GC/MS方法测得的谱图在1. 5~6min之间形 成两个大峰，而结合了冷阱聚焦技术后峰形得到了明显的改善，不但成功分离出低沸点的 有机物，而且个别组分响应也明显提高了。
[003引b、柱溫的优化
[0037] 如图1中化）所示，绝大部分物质集中在1~12min被检出，在原来的程序升溫条 件下（35°C保持Imin，Wl〇°C/min的速度升溫到150°C，再W15°C/min升到230°C)虽能 进行分离，但是效果不理想。随着研究的不断深入，样品的不断积累，我们发现此柱溫下，部 分复杂样本特别是癌症患者胸腔积液中的高挥发性有机物分离效果并不理想，常常出现重 叠峰，包埋峰，拖尾峰的情况，给之后的数据分析带来一定的困难。因此，为了尽可能满足不 同胸腔积液样品的分离分析要求，特别是高挥发性有机物的分离，同时考虑冷阱聚焦作用 的影响，实验中应尽量放宽程序升溫条件。本研究中，选取一个腺癌患者（女，89岁）胸腔 积液样本为例，考察了两种不同的程序升溫条件（a.初溫35°C保持Imin，Wl〇°C/min的速 度升溫到150°C，再W15°C/min升到230°C;b.初溫35°C保持3min，W5°C/min的速度升 溫到80°C，再Wl〇°C/min升到230°C)对实验结果的影响。图2为不同程序升溫条件下胸 腔积液的气相色谱质谱图，放缓升溫速率后，样品的出峰情况总体上得到了明显的改善。不 但2min左右的几个低沸点有机物得到了良好的分离，后面2个峰强度较高的有机物（环己 酬和异辛醇）峰形拖尾也得到改善。故后续实验中选用化）中的程序升溫模式。
[0038] C、样品用量及解析时间的选择
[0039] 考虑到胸腔积液样品来源特殊，样本量少lOmL)且较难得到，通过稀释样本来 增加利用率容易造成生物样本指纹图谱信息的失真，而冷阱的聚焦作用在一定程度上提高 了方法的灵敏度，或许更小剂量的取样量也能够满足分析的要求。因此，本实验W-个结核 性胸膜炎患者（男，87岁）的胸腔积液样本为例，选取ImL和2mL两个剂量进行试验，W所 有有机物的出峰情况来综合考虑样品剂量的影响，结果绝大多数的色谱峰并没有明显的变 化，本试验最终WImL取样量作为最终实验条件，供后续分析研究。
[0040] 考虑到冷阱聚焦作用对样本组分的二次富集浓缩，样品在进样口的最佳解析时间 需要重新考察，本实验W252号样本为例，考察了解析时间（lmin，3min，5min)对实际胸腔 积液检测的影响，发现Imin解析时间的峰强度普遍较小，而3min和5min较大，部分有机物 峰强度在解析时间为5min时呈现下降趋势，因此最终选择3min为本实验的最佳条件。
[00川 t重现性考察
[0042] 为了验证该方法的重现性，实验中对同一胸腔积液样本进行=次平行取样，在优 化后的HS-SPME-冷阱聚焦-GC/MS条件下分别进行测定得到其总离子流图（图3)。从图3可W看出=张色谱图的出峰数量和峰强度大体上没有明显的差别，谱图有较好的重现性。 当然，其中也不可避免的出现了较多硅氧烷类的干扰峰。因此，为了更准确的比较，根据质 谱选择离子的方法对该样本中检测到的21个有机物的峰面积分别进行积分，计算其RSD值 在1. 35~13. 39%之间，结果表明，在规范的操作下，该技术检测到的胸腔积液样本中大部 分的挥发性有机物重现性良好，运也为大量样本的重复试验和数据比较的准确性提供了保 障。
[004引实施例2 :不同胸腔积液样本中挥发性有机物的检测分析
[0044] 28个胸腔积液样本和临床资料分别取自11例癌症患者（恶性组）和17例良性 疾病患者（良性组），均由浙江省人民医院呼吸内科采用胸腔穿刺术集中于2014年1月至 2014年12月之间采集。癌症患者一经确证入院后，即在第二天清晨空腹抽取胸腔积液样 本，良性对照组患者也在清晨空腹抽取胸腔积液样本。实验人员用内置医用冰袋的密封保 溫盒将样品取回，储存于-20°C冰箱中待用。其中，11例恶性胸腔积液样本中肺癌患者9例， 结肠癌1例，肝癌1例，17例良性胸腔积液样本中结核性胸膜炎11例，肺炎2例，其他4例 (脈胸、肺脈肿、甲状腺功能减退、冠屯、病伴屯、包积液）。
[0045]在实施例1优化的方法条件下，对W上28个实际样品进行了检测分析，得到了峰 强度适中、分离度良好的胸腔积液气相色谱质谱谱图。图4为典型的良恶性胸腔积液总离 子流图。如图所示，胸腔积液中含有大量的挥发性有机物，恶性胸腔积液中的有机物数量普 遍比良性胸腔积液中的数量多，而且恶性胸腔积液中大部分的有机物的峰强度也高于良性 胸腔积液中相应的峰的强度。为了比较良恶性胸腔积液中VOCs的差异，首先对28个胸腔 积液中检测到的有机物进行结构鉴定，质谱Nist2. 0谱库检索结合人工解析，共得到65个 匹配度较高（>73.4%)的VOCs。表1列出了运些化合物的保留时间、名称、分子式、分子 量、特征碎片、CAS号、匹配度W及它们在良恶性组检出的频率。
[0046] L/IN iWU丄丄UWOU A 一 * * *? (/丄^><
CN105116085A 说明书 8/10 页
[0049] 结果表明大部分有机物的检出率在20~80%左右，检出率波动范围较大，同时高 挥发性的有机物检出的频率普遍比低挥发性的要高，绝大部分的物质在良恶性疾病组间出 现的频率是相近的。运也说明某种挥发性有机物的存在与否并不能拿来直接判断良恶性胸 腔积液的类型。但是各疾病所引起的代谢素乱的程度不同，其产生的小分子代谢物的峰强 度可能是不一样的，所W需要进一步对样本进行定量分析来判别良恶性胸腔积液中的挥发 性小分子有机物是否存在一定的差异。
[0050] 鉴定出的65个有机物可W分为醇类、醒类、酬类、醋类、烧締控类、苯及其衍生物、 杂环化合物、祗类W及未分类的其他化合物。由此可见，胸腔积液中挥发性有机物主要W饱 和烧控类、含氧化合物W及苯系衍生物为主。其中，乙醇、丙酬、2-甲基戊烧、3-甲基戊烧、 乙酸乙醋、四氨巧喃、甲基环戊烧、环己烧、苯、正下醇、2-戊酬、庚烧、甲苯、己醒、辛烧、2， 4-二甲基庚烧、4-甲基辛烧、二甲苯、乙基苯、苯酪、环己酬、2-乙基-1-己醇（异辛醇）、壬 醒等二十多个物质被先后报道出现在肺癌患者的呼吸气、血液、尿液和细胞组织中，并且被 认为是潜在的肺癌标志物；1-辛締-3醇、正己醒、辛烧被认为是肝癌肿瘤标志物，运也说明 胸腔积液是一个筛选肿瘤标志物很好的生物样本，其包含的与病变相关的小分子物质可能 比血液、尿液、组织中更加丰富。
[0051] 图5为28例良恶性胸腔积液中各化学类别物质的平均峰面积柱状图。由图可知， 良恶性胸腔积液中的有机物的峰强度是完全不一样的。恶性胸腔积液组中除了烧締控类物 质的峰强度略低于良性组外，其他类别的有机物平均峰强度均高于良性组。其中，醇类、酬 类、醒类和醋类的平均峰面积差异比较明显，即含氧小分子有机物在良恶性胸腔积液中的 代谢表达是明显不同的，可作为重点观察对象。其次，良恶性组内的主要有机物类别也是有 差异的。恶性组中主要为酬类、醇类和醋类，而良性组中主要为酬类、醇类和苯及衍生物类。
[0052] 实施例3 :肺癌和肺部良性疾病患者胸腔积液中挥发性有机物的比较分析
[0053] 18例胸腔积液样本和临床资料分别取自9例肺癌患者（癌症组）和9例肺部炎症 患者（炎症组），其中，9例肺癌胸腔积液样本中腺癌5例，其他4例未明确肺癌类型，9例良 性胸腔积液样本中结核性胸膜炎7例，肺炎