第8段中详述的一系列"应激"和"反应激"酶 活性测试来表征。在乙醇提取后测定总药物。将等分的脂质体分散体（50yL)用乙醇稀 释至2mL以释放脂质体包封的考布他汀A4。使用HPLC，用C18柱（Nova-Pak 3. 9X 150mm 柱，Waters)以及甲醇：水（50:50)作为流动相，确定在该清澈的乙醇提取物中的总考布 他汀A4。使用0· 8mL/min的流速和295nm处UV检测。使用Centricon离心式过滤装置 (Centricon 10, MffCO IOkd, Millipore, Bedford, MA)从脂质体包封的部分分离游离的考布 他汀A4。（IOOyL)用水合缓冲液（50mM HEPES/150mM NaCI-缓冲液pH 6. 5)将等分的脂质 体分散体稀释至lmL，并将该样品转移至离心式过滤装置。在固定角离心机中以1000 Orpm 离心样品15分钟。然后，使用HPLC确定滤液中的游离考布他汀A4。计算总的和游离的药 物考虑稀释因素。总的药物减去游离的药物得到脂质体捕获的药物的量。一式三份完成药 物估算，以平均值土SEM报告值。可以使用另一种药物改变这种方法。
[0125] 5、可视化和粒度测量
[0126] 在挤出过程前，使用光学显微镜（Olympus, CKX41，东京，日本）可视化大的MLV。 通过负染色技术在电子显微镜下可视化最终的脂质体。稀释的脂质体样品被吸附于聚 醋酸甲基乙稀脂（formavar)-和碳-涂布的铜栅上，用2%乙酸双氧铀（pH 7.0)染色， 并用JEM1200EX电子显微镜（JE0L，东京，日本）在X50000放大下观察。使用Malvern Zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments,伍斯特郡，英国）通过动态光散射法监测脂质 体的粒度和粒度分布图。
[0127] 6、体外渗漏研究
[0128] 通过对保持在37°C的700体积反渗透水透析样品48h，在体外监测考布他汀A4的 脂质体包封稳定性。
[0129] 将0· 5mL等分的脂质体分散体放置于预浸的Pierce透析盒（Siide-A-Lyzer, MffCO IOkd, Millipore)中，然后将所述透析盒放置于含预平衡至37°C的350mL释放介质的烧杯 中。所述透析盒以IOOrpm旋转。基于仔细考虑的漏槽条件（sink conditions)和分析方 法的灵敏度来选择释放介质的体积。在不同的时间点，从释放介质中取出0. 5mL样品，并用 等体积的新鲜释放介质替换。使用HPLC分析方法，分析样品释放的药物考布他汀A4。
[0130] 从脂质体制剂的总药物浓度，计算每个时间点释放的百分比。结果以平均值 土 SEM (η = 3)报告。
[0131] 7、秀丽隐杆线虫中小分子的高通量筛选
[0132] 根据已确立的方案（Lewis和Fleming, 1995 ;Stiernagle, 1999)进行懦虫培养。根 据Burns等人（2010和2006)进行HTS实验。晚期第四幼虫阶段的蠕虫（其生长自在NA22 大肠杆菌上于25°C生长45h的同步孵化的幼虫（synchronized hatchlings))用于积累测 试。收集蠕虫，洗涤至少两次并重新悬浮于足够的M9缓冲液1中至~10只蠕虫每yL的 最终浓度。将五百微升这种懦虫混悬液加入至Pall AcropPrep 96孔过滤板（0.45 μ m GHP 膜，孔容积lml)的每个孔中。
[0133] 将脂质体加入至每个孔中以获得40 μ M(0. 4% DMS0, v/v)的化学物质的最终浓 度。于20°C，将懦虫在小分子溶液中通风（with aeration)孵育6h，然后通过真空装置从 孔中排出孵育缓冲液（如果孵育长于6h，过滤膜变弱）。
[0134] 然后，用500 μ L M9缓冲液洗涤蠕虫三次。洗涤后，将蠕虫重新混悬于50 μ L M9 缓冲液中，转移至新的96孔底部固定板上并于-20°C冷冻储存。然后，通过向每个孔中加 入 50μ1 2X 裂解液（IOOmM KCl，20mM Tris，pH 8.3,0.4% SDS, 120yg ml 1 蛋白酶 K)裂 解样品，并将板于60°C搅拌孵育Ih。裂解后，将板冷冻储存于-80°C以供之后的HPLC处理 (参见 Burns 等人（2〇10)中的 Supplementary Methods for the full HPLC methods)。
[0135] 8、秀丽隐杆线虫2中小分子的处理后HTS
[0136] 秀丽隐杆线虫是一系列广泛的应用的通用体内平台（Jones等人，2005 ; Artai-Sanz, 2006)，所述应用如人类药物筛选、药物祀点鉴定和验证、或药物作用的模式、 药物命中物和先导物的ADME (吸收、分布、代谢和清除/排泄）和毒性参数筛选以及异型生 物质对生态和环境的毒性、美容术、主要细胞信号通路的研究如细胞凋亡、炎症、氧化应激、 呼吸作用、细胞活力（cell energetic)、化学物质和细菌毒素造成的水（血液透析、饮用 水、用于胃肠外注射）污染的控制，等等。
[0137] 在所有这些应用中，ADME-Tox参数是最具挑战性的任务，因为医药工业仍然面临 着最近在临床阶段显示的有害的先导药物毒性。
[0138] 只要仅与本发明相结合，秀丽隐杆线虫可以是用于实现这种筛选的非常有效的工 具。
[0139] 以上提及的不同领域的应用需要用于分析用药物处理的秀丽隐杆线虫的大量实 验技术。
[0140] 在可用的技术中，最流行的是生化测试（酶学、蛋白组学、代谢组学、转录组学、 miRNA等）、细胞成像、诱变、基因敲除等。
[0141] 8. 1.毒性筛选
[0142] 表1总结了可以在蠕虫中测量的毒性终端（endpoints)。这些终端涉及医药工业 或美容术，例如分别地它们的主导治疗和化妆品用化合物。
[0143] 如段7所述，毒性筛选可以在储存于_80°C的冷冻的蠕虫上容易地实现。例如，可 以基于之前Kramer等人在2005年所描述的方案在医院生化实验室设备上自动测量呼吸链 复合物活性。
[0144] 此外，抗应激的酶和代谢物也可以在相同的样品上测量，如SOD (McCord和 Fridovich, 1969)、GPX (Paglia 和 Valentine, 1967)、GRed、氧化的和还原的谷脫甘肽 (Beutler 和 Mitchell, 1968)、G6PDH(Krien 等人，1992)。
[0145] 活性自由基氧物种的过剩、一种或数种主要细胞代谢途径的改变、应激和抗应激 酶活性失衡的修饰，可以在几百只蠕虫上快速而准确地测量。
[0146]
[0147] 8. 2.通过LC-MS的化学物质代谢物的分析
[0148] 由蠕虫裂解液HPLC-纯化代谢物，并使用Savant DNA120 SpeedVac干燥（不将酸 加入至HPLC溶剂中）。
[0149] 使用nano-AQUITY超高效液相色谱（UPLC)系统（Waters公司）进行用于LC-MS的 纯化代谢物的色谱分离（完整方法参见Burns等人（2010)中的Supplementary Methods)。
[0150] 使用Micromass四极杆-飞行时间串联仪（Waters公司）进行质谱分析。使用的 数据采集软件是MassLynx NT，版本4.0。在正离子模式下，使用毛细管电压和样品锥电压 分别设定为3000V和20V的nano-ESI，获得质谱。MS采集速率设定为I. 0s，其中有0.1 s的 内扫描延迟（interscan delay)。百分之九十八氩气用作碰撞气体，对于100-1000m/z的质 量范围碰撞能量为13-46V。在原始LC-MS运行的手动分析后，确定选择用于LC-MS-MS的离 子，并生成相应的包含列表（inclusion list)用于作为目标的数据依赖的采集实验。
[0151] 8. 3.用于ADME Tox筛选的秀丽隐杆线虫的不同株
[0152] 秀丽隐杆线虫的数种野生型（WT)株是可获得的（特别参见https://www. cbs. umn. edu/cgc/strains (生命科学学院，明尼苏达大学），最常见的是株N2)。
[0153] 通过测量特定的化学物质在不同的WT株中的积累诱导的相同生化改变，能够验 证与特定毒性机制相关联的准确的生物标志物。
[0154] 通过跟踪毒性随着时间的进展，能够预测这样的改变对蠕虫寿命的影响。
[0155] 也存在很多秀丽隐杆线虫的突变株，例如可在美国明尼苏达隐杆线虫属 (Caenorhabditis)遗传中心获得。
[0156] 细胞代谢途径中一种或数种分子作用物敲除的株对于预测哺乳动物中的药物毒 性是非常有用的。
[0157] 事实上，在哺乳动物和秀丽隐杆线虫中解毒机制是非常相似的（Lindblom和 Dodd, 2006) 〇
[0158] 秀丽隐杆线虫线粒体的结构和功能，特别是有关氧化应激的结构和功能，与在人 类中观察到的那些非常接近（Murfitt等人1976)。
[0159] 发现了参与异型生物质代谢的主要酶：细胞色素P450(78个基因）、短链脱氢 酶-SDR(68个基因）、或UDP-葡萄糖醛酸转移酶糖基-UGT(63个基因）、黄素-单氧化 酶-FMO (5个基因）、谷胱甘肽S转移酶-GST (48个基因）、磺酸基转移酶、甲基转移酶、乙酰 基转移酶等。
[0160] 也令人感兴趣的是，载体ATP结合盒（60个基因）的存在也参与异型生物质的转 运。
[0161] 此外，肠细胞和形成线虫排泄系统的那些细胞呈现在人体中发现的肝脏和肾脏的 同等功能。
[0162] 数种比较研究已经建立了在线虫中测试其潜在的毒性的物质的分类，显示出 与在啮齿动物中作出的测量结果的相关性（Cole等人，2004 ;Dengg和van Meel，2004 ; Williams等人，2000)。这些研究证实了秀丽隐杆线虫作为模型生物体用于评估药物毒性。
[0163] 通过比较在WT中和突变株中相同化学物质诱导的改变，能够在改变的细胞代谢 途径中鉴定并量化数种分子作用物之间的功能性相互作用。
[0164] 热敏突变株TJ1060(在20-25°C的正常生长条件下不育）的使用，允许克服蠕虫的 快速生育周期固有的问题，并限制板孔中个体的数量。对于在重复剂量下慢性毒性的研究， 这是主要的优势。
[0165] 株如CL2166表达在谷胱甘肽转移酶GST-4启动子的控制下偶联于GFP的一些基 因。这种酶在异型生物质刺激后表达并参与其代谢。
[0166] 在株TJ375中，GFP表达由HSP 16-2启动子控制。HSP对败血症（s印sis)、化学 物质和毒性应激敏感并且可以被认为是细胞应激标记。
[0167] 参考文献
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