快速高灵敏同步定量检测叶片总叶酸及叶酸衍生物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS)快速且高灵敏度同步检测 植物叶片总叶酸及七种叶酸衍生物含量的方法。
【背景技术】
[0002] 叶酸是一种具有重要营养价值的水溶性B族维生素，是指四氢叶酸及其衍生物这 一类物质，它由蝶啶、对氨基苯甲酸和谷酰基链组成。作为一碳供体，叶酸参与嘌呤、嘧啶的 合成和氨基酸的相互转化。人体缺少叶酸会导致一系列的慢性疾病，例如神经管缺陷、先天 缺陷、巨红血球性贫血、心血管疾病和癌症等。然而，人类和哺乳动物不能自行合成叶酸，只 能通过食物补充。但是，人们通过日常饮食摄入的叶酸含量低于健康标准（400 yg每天）， 因此，全球许多国家都在致力于通过生物强化的手段增加植物的叶酸含量，从而使人类可 通过日常饮食摄入更多的叶酸。蔬菜是人类主要的膳食，蔬菜叶酸的生物强化也是全球目 前研究热点之一，然而蔬菜中叶酸的含量很低，并且含有多种不稳定的衍生物，因此建立一 种高灵敏度、高效稳定地检测植物叶片中叶酸含量的方法非常必要。
[0003] 由于植物中叶酸有许多结构类似物，并且不稳定，因此分析植物叶片的叶酸含量 是一种挑战，而叶酸的提取过程是关键。由于叶酸对光、氧化剂和PH都非常敏感，因此缓冲 液的pH和热处理都会影响到叶酸的稳定性。作物中叶酸主要以多谷氨酸盐的形式存在，即 便是以单谷氨酸盐形式存在，也常是多种衍生物共存，因此需用叶酸辄合酶达到去辄合作 用。叶酸辄合酶可用人类或大鼠的血清、猪肾脏和鸡胰脏等，选择适宜的叶酸辄合酶才能在 提取过程中充分发挥去辄合作用。
[0004] 目前测定叶酸的方法有微生物法，但其只能测定总叶酸，不能区分叶酸衍生物，并 且实验操作繁琐费时。现在也有越来越多使用气相色谱或液相色谱的方法测定植物和食物 中的叶酸，但是气相色谱也不能区分不同的叶酸衍生物。不同的叶酸衍生物的生理功能各 不相同，因此有效地区分它们非常重要。液相色谱可以有效区分不同形式的叶酸衍生物，但 目前较多报道利用高效液相紫外检测器法检测组成单一、叶酸含量高的样品，不适宜检测 叶酸含量低的样品，而且，此种方法检测时间较长，若批量检测则叶酸容易在检测过程中降 解，因此只能检测少量样品。所以，建立稳定快速地提取植物叶片的叶酸并快速、高效、高灵 敏度、批量同步检测植物叶片中叶酸含量及其不同叶酸衍生物含量的方法对植物生物强化 相关领域研究具有重要意义。
[0005] 2011100064527的发明《同步定量测定蔬菜中总叶酸及其衍生物含量的方法》存在 着叶酸样品准备时间较长、测量时间长、同步只能检测叶酸及四种叶酸衍生物的技术缺陷。 而本方法叶酸样品准备时间短、检测时间只需5分钟，可以同步定量检测叶酸及七种叶酸 衍生物。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS) 快速高灵敏度同步测定植物叶片总叶酸及其衍生物含量的方法。应用此种方法可以快速同 步测定植物叶片中总叶酸及多种叶酸衍生物的含量。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供快速高灵敏同步定量检测蔬菜中总叶酸及其 衍生物含量的方法，依次包括以下步骤：
[0008] 1)、提取植物叶片中的叶酸及叶酸衍生物：
[0009] 利用0. 05M磷酸缓冲液煮沸提取植物叶片的叶酸，冷却并离心后，得上清液，上清 液为叶酸提取物（包括叶酸及叶酸衍生物）；
[0010] 2)、添加两种叶酸辄合酶
[0011] 往步骤1)中的叶酸提取物添加老鼠血清辄合酶和鸡胰腺辄合酶，加入氩气后 37°C孵育2小时，100°C水浴5分钟终止酶活，离心后取上清液，上清液为叶酸去辄合提取 物；
[0012] 3)、使用超滤离心管纯化植物叶片叶酸去辄合提取物
[0013] 使用IOkDa 500 yL超滤离心管（Millipore，美国），活化后，往里加入500 yL步 骤2)得的叶酸去辄合提取物，12000g 4°C离心15分钟，得到纯化后的叶酸纯化液（为过柱 后所得的溶液）；
[0014] 4)、超高效液相色谱质谱联用分离叶酸衍生物质谱方法
[0015] 超高效液相色谱质谱联用检测系统为四极杆串联质谱（Waters Xevo TQ-S, Waters,美国）常压电喷雾电离（ESI)正极模式。Waters IntelliStart Technology通过自动和手动优化所有叶酸衍生物的多离子反应监测（multiple reaction monitoring, MRM)。每一种叶酸衍生物使用两个或三个子离子确定，结果如表1。MassLynx 4. I (Waters，美国）软件用于系统运行、数据采集和数据分析。
[0016] 表1叶酸及叶酸衍生物的多离子反应检测和化合物指标
CN 105181829 A 说明书 3/15 页
[0019] 5)、超高效液相色谱质谱联用分离叶酸衍生物色谱方法
[0020] 使用Waters ACQUITY UPLC系统（Waters，美国）进行叶酸衍生物的色谱分离，运 行软件为TargetLynx 4. I (Waters，美国）。柱温箱维持40°C，自动进样器维持4°C。色谱柱 是八0〇1]打￥皿1^：8^1，(：18(3〇11111111，规格为2.111111^5〇111111，粒径1.7 4111(^丨618，美国）连接一 个 VanGuard前置柱 C18,规格为 5_X 2. 1mm,粒径 I. 8 μ m(Waters，美国）。流速0· 4mL/min ； 进样量2yL，运行时间5分钟。流动相为洗脱液A(0. 1%甲酸溶于水）和洗脱液B(0. 1%甲 酸溶于乙腈）梯度洗脱，详见表2。针头清洗溶剂为乙腈/水混合液（50/50, v/v);
[0021] 表2 UPLC-MS/MS最佳梯度洗脱
[0024] 6)、植物叶片叶酸衍生物的定量测定。
[0025] 作为本发明高效高灵敏同步定量检测植物叶片总叶酸及其衍生物的方法的改进： 步骤1)中的0. 05M磷酸缓冲液浓度为每升加入IOg L(+)-抗坏血酸和IOml二巯基丙醇的 磷酸缓冲液。
[0026] 作为本发明高效高灵敏同步定量测量植物叶片总叶酸及其衍生物的方法的进一 步改进：所述步骤2)中在每IOmL叶酸提取物中加入2mL鸡胰腺辄合酶，摇匀后，吸取3mL溶 液于50mL离心管中，加入100 μ L老鼠血清辄合酶，摇匀，充入氩气，37°C孵育2小时，100°C 水浴5分钟终止酶活。
[0027] 作为本发明高效高灵敏同步定量检测植物叶片总叶酸及其衍生物的方法的进一 步改进：所述步骤6)为：根据步骤4)和步骤5)的条件，对植物叶片叶酸及其衍生物进行 定量测定，记录主峰峰面积，按照外标法以峰面积自动计算得出四氢叶酸、5-甲基-四氢叶 酸、5-甲酰-四氢叶酸、5, 10-次甲基四氢叶酸、10-甲酰-叶酸、10-甲酰-四氢叶酸、叶酸 的含量，再根据四氢叶酸、5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸、5, 10-次甲基四氢叶酸、 10-甲酰-叶酸、10-甲酰-四氢叶酸、叶酸的浓度和相对分子质量计算总叶酸含量。
[0028] 本发明的方法包括以下：(A)提供一种磷酸缓冲液煮沸提取植物叶片中叶酸的方 法；(B)提供两种叶酸辄合酶混合使用的方法；(C)提供一种超滤离心管纯化植物叶片叶酸 提取物的方法；(D)提供一种检测系统为四极杆串联质谱（Waters Xevo TQ-S，Waters，美 国）常压电喷雾电离（ESI)正极模式的质谱分离植物叶片中各种叶酸衍生物的方法；(E) 提供一种色谱柱分离植物叶片中各种叶酸衍生物的方法；(F)提供一种用超高效液相色 谱-串联质谱高效高灵敏度同步测定植物叶片中不同叶酸衍生物的方法。
[0029] 本发明的植物叶片中不同叶酸及其衍生物含量测定方法，具有以下特点：
[0030] (1)同时添加老鼠血清辄合酶与鸡胰腺辄合酶，预防叶酸的氧化破坏，提高去辄合 效率。
[0031] (2)本发明中，使用规格500 μ LlOkDa超滤离心管纯化叶酸提取物，离心机一次可 以离心30个样品，既能有效过滤杂质，又大大加快了提取速度，减少叶酸及其衍生物在提 取过程中的降解。
[0032] (3)ACQUITY UPLC ΒΗ1，C18C0Iumn色谱柱结合超高效液相色谱四极杆串联质谱 (UPLC-MS/MS) (Waters Xevo TQ-S，Waters,美国）结合常压电喷雾电离（ESI)正极模式可 以同时分离和定量测定植物叶片七种叶酸衍生物，并且只需5分钟即可检测完毕，进样量 只需2 μ L，检测方法高效灵敏，可批量检测样品。
[0033] 本发明植物叶片中不同叶酸及其衍生物含量测定方法，具有以下有益效果：
[0034] (1)本发明灵敏度高、快速高效，可批量同步检测成分复杂，低叶酸含量的植物叶 片的叶酸及其衍生物含量的测定。
[0035] (2)本发明可以分离植物叶片中的七种叶酸衍生物，并可以定量分析总叶酸及七 种叶酸衍生物含量。
【附图说明】
[0036] 下面结合附图对本方法【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0037] 图1是不同叶酸衍生物的结构图；
[0038] 图2是UPLC-MS/MS测定不同形式叶酸衍生物的色谱图。所用样品为市场购得的 小白菜，按照本方法制得叶酸提取物，但在步骤1)添加〇. 05M磷酸缓冲液同时添加混合标 样（混合标样为七种叶酸衍生物标准品的混合物，每种衍生物添加量为〇. 5 μ g/100g)。样 品按照本方法的条件进行测定，进样量为2 μ 1，检测时间5分钟。10-CH0-THF，10-甲酰-四 氢叶酸；5-CH0-THF，5-甲酰-四氢叶酸；10-CH0-FA，10-甲酰-叶酸；M-T