0106] 取市场购买的小白菜、菠菜、生菜和温室种植的水稻叶片样品，按照2. 1-2. 3方法 制得叶酸提取溶液，同时制备标准叶酸衍生物溶液，按照上述2. 4-2. 5的超高效液相色谱 质谱联用的质谱条件和色谱条件测定，进样量2 μ L，记录峰面积，制得各叶酸衍生物的标准 曲线，并根据外标法以峰面积获得叶酸衍生物浓度（ng/mL)，再根据2. 6的公式计算供试样 品的总叶酸含量和各叶酸衍生物含量（μ g/l〇〇g)，结果见表8。由表8可见，菠菜总叶酸含 量最高，达223. 74 μ g/100g，其次是小白菜，总叶酸含量207. 851 μ g/100g，生菜和水稻叶 片总叶酸含量相近，分别是117. 458 μ g/100g和118. 303 μ g/100g。在生菜中，主要叶酸衍 生物为5-甲基-四氢叶酸和四氢叶酸；菠菜主要叶酸衍生物为5-甲基-四氢叶酸、5-甲 酰-四氢叶酸和5, 10-次甲基四氢叶酸；小白菜主要叶酸衍生物为5-甲基-四氢叶酸和 5-甲酰-四氢叶酸；水稻叶片主要叶酸衍生物为5-甲基-四氢叶酸和5-甲酰-四氢叶酸。
[0107] 表8生菜、菠菜、小白菜和水稻叶片叶酸及其衍生物含量
[0109] 此试验证明，本方法可以有效提取并快速同步检测生菜、菠菜、小白菜、水稻叶 片的七种叶酸及叶酸衍生物，分别是四氢叶酸、5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸、 5, 10-次甲基四氢叶酸、10-甲酰-叶酸、10-甲酰-四氢叶酸和叶酸。并且，本方法灵敏度 高，可以检测到叶酸含量低的植物叶片的叶酸及其衍生物，可以有效检测生菜、菠菜、小白 菜和水稻叶片的5, 10-次甲基四氢叶酸、10-甲酰叶酸、10-甲酰四氢叶酸和叶酸的含量，在 国内尚属首次。
[0110] 对比例1、将步骤2. 2中的" 2mL鸡胰腺辄合酶"改成" 6 μ L α -淀粉酶"，其余等 同于本发明的实施例2 (仅对小白菜进行检测）。
[0111] 对比例2、将步骤2. 2中的"2mL鸡胰腺辄合酶"改成" 15 μ L去蛋白酶"，其余等同 于本发明的实施例2 (仅对小白菜进行检测）。
[0112] 对比例3、将步骤2. 2中的"2mL鸡胰腺辄合酶"改成"6 μ L α -淀粉酶和15 μ L 去蛋白酶"，其余等同于本发明的实施例2 (仅对小白菜进行检测）。
[0113] 对比例4、将步骤2. 2改成：加完2ml鸡胰腺辄合酶，吸取3ml到新的离心管后，再 加"6yL α-淀粉酶和15yL去蛋白酶"和"100yL老鼠血清辄合酶"。其余等同于本发明 的实施例2 (仅对小白菜进行检测）。
[0114] 上述所有对比例的检测结果如表9所示。表9可见，对比例4与实施例2的使用 效果均最佳，但前者需多加6 μ L α -淀粉酶和15 μ L去蛋白酶，因此本发明的方法采取的 鸡胰腺辄合酶与老鼠血清辄合酶混合使用最为经济高效。
[0115] 表9不同的辄合酶搭配使用对测定小白菜叶酸总含量影响
[0117] 对比例5、步骤2. 2中"37°C水浴孵育2小时，"改成"37°C水浴孵育0. 5小时，"， 其余等同于本发明的实施例2 (仅对小白菜进行检测）。
[0118] 对比例6、步骤2. 2中"37°C水浴孵育2小时，"改成"37°C水浴孵育1小时，"，其 余等同于本发明的实施例2 (仅对小白菜进行检测）。
[0119] 对比例7、步骤2. 2中"37°C水浴孵育2小时，"改成"37°C水浴孵育4小时，"，其 余等同于本发明的实施例2 (仅对小白菜进行检测）。
[0120] 对比例8、步骤2. 2中"37°C水浴孵育2小时，"改成"37°C水浴孵育6小时，"，其 余等同于本发明的实施例2 (仅对小白菜进行检测）。
[0121] 对比例9、步骤2. 2中"37°C水浴孵育2小时，"改成"37°C水浴孵育24小时，"，其 余等同于本发明的实施例2 (仅对小白菜进行检测）。
[0122] 上述所有对比例的检测结果如表10所示。表10可见，水浴孵育时长对小白菜总 叶酸含量的影响从2小时后开始达到稳定水平，为了节约样品处理时间，本方法采用2小时 水浴孵育时长最佳。
[0123] 表10水浴孵育时长对测定小白菜叶酸总含量影响
[0124] CN 105181829 A 说明书 15/15 页
[0125] 对比例10、步骤2· 3中"超滤离心管（10kDa，Millip〇re，美国）"改成"超滤离心 管（5kDa，Millip〇re，美国），其余等同于本发明的实施例2(仅对小白菜进行检测）。检测 结果如表11所示。从表11可见，IOkDa规格的超滤离心管效果更佳，且IOkDa规格的超滤 离心管价格更低。
[0126] 表11不同超滤离心管规格对测定小白菜叶酸总含量影响
[0128] 以上举例仅仅是本发明的两个具体实例。根据以上实例可以证明，本发明所述的 超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS)同步测定蔬菜总叶酸及叶酸衍生物含量的方法 是高效快速、灵敏度极高、精确度高、回收率高，可以批量同步定量检测低含量叶酸植物叶 片的7种叶酸及叶酸衍生物的方法。这种方法可以应用于蔬菜生物强化领域，也可以应用 于研究者对植物叶酸及其衍生物方面的研究。该领域的其他技术人员从本发明公开的内容 中直接推导出的或联想到的其他变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1.快速高灵敏同步定量检测叶片总叶酸及叶酸衍生物的方法，其特征是依次包括以下 步骤： 1) 、提取植物叶片中的叶酸及叶酸衍生物： 利用0. 05M磷酸缓冲液煮沸提取植物叶片的叶酸，冷却并离心后，得上清液，上清液为 叶酸提取物； 2) 、添加两种叶酸辄合酶： 在步骤1)中的叶酸提取物中添加老鼠血清辄合酶和鸡胰腺辄合酶，充入氩气后37°C 孵育2小时，100°C水浴5分钟终止酶活，离心后取上清液，上清液为叶酸去辄合提取物； 3) 、使用超滤离心管纯化植物叶片叶酸去辄合提取物： 使用IOkDa 500 μ L超滤离心管，活化后，往里加入500 μ L步骤2)所得的叶酸去辄合 提取物，12000g4°C离心15分钟，获得纯化后的叶酸纯化液； 4) 、超高效液相色谱质谱联用分离叶酸衍生物质谱方法： 超高效液相色谱质谱联用检测系统为四极杆串联质谱常压电喷雾电离（ESI)正极模 式；Waters IntelliStart Technology通过自动和手动优化所有叶酸衍生物的多离子反应 监测（multiple reaction monitoring, MRM);每一种叶酸衍生物使用两个或三个产物离子 确定，MassLynx 4. 1软件用于系统运行、数据采集和数据分析，如下表1 ; 表1叶酸及叶酸衍生物的多离子反应检测和化合物指标5) 、超高效液相色谱质谱联用分离叶酸衍生物色谱方法： 使用Waters ACQUITY UPLC系统进行叶酸衍生物的色谱分离，运行软件为 TargetLynx4. 1 ;柱温箱维持40°C，自动进样器维持4°C ;色谱柱是ACQUITY UPLC BEH，C1S column，规格为2. ImmX 50mm，粒径L 7 μ m连接一个VanGuard前置柱C18，规格为 5mmX 2. 1mm，粒径L 8 μ m ;流速0· 4mL/min ;进样量2 μ L，运行时间5分钟；流动相为洗脱液 Α(0. 1%甲酸溶于水）和洗脱液Β(0. 1%甲酸溶于乙腈）梯度洗脱，详见表2 ;针头清洗溶剂 为乙腈/水混合液（50/50，v/v); 表2、UPLC-MS/MS最佳梯度洗脱6) 植物叶片叶酸衍生物的定量测定。2. 根据权利要求1所述的高效高灵敏同步定量检测植物叶片总叶酸及其衍生物的方 法，其特征是：所述步骤1)中的0. 05Μ磷酸缓冲液为每升加入IOgL (+)-抗坏血酸和IOml 二巯基丙醇的磷酸缓冲液。3. 根据权利要求2所述的高效高灵敏同步定量测量植物叶片总叶酸及其衍生物的方 法，其特征是：所述步骤2)中在每IOmL叶酸提取物中加入2mL鸡胰腺辄合酶，摇匀后，吸取 3mL溶液于50mL离心管中，加入100 μ L老鼠血清辄合酶，摇勾，充入氩气，37°C孵育2小时， 100 °C水浴5分钟终止酶活。4. 根据权利要求3所述的高效高灵敏同步定量检测植物叶片总叶酸及其衍生物的方 法，其特征是：所述步骤6)为：根据步骤4)和步骤5)的条件，对植物叶片叶酸及其衍生物 进行定量测定，记录主峰峰面积，按照外标法以峰面积自动计算得出四氢叶酸、5-甲基-四 氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸、5, 10-次甲基-四氢叶酸、10-甲酰-叶酸、10-甲酰-四氢叶 酸、叶酸的含量，再根据四氢叶酸、5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸、5, 10-次甲基四 氢叶酸、10-甲酰-叶酸、10-甲酰-四氢叶酸、叶酸的浓度和相对分子质量计算总叶酸含 量。
【专利摘要】本发明公开了一种快速高灵敏同步定量检测植物叶片总叶酸及叶酸衍生物含量的方法，依次包括以下步骤：1)0.05M磷酸缓冲盐提取植物叶片中的叶酸；2)在步骤1)的叶酸提取物中添加老鼠血清轭合酶和鸡胰腺轭合酶；3)使用超滤离心管纯化去轭提取物；4)使用超高效液相色谱串联四极杆质谱常压电喷雾电离(ESI)正极模式分离和测定四氢叶酸、5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸、5,10-次甲基四氢叶酸、10-甲酰-叶酸、10-甲酰-四氢叶酸、叶酸在内的七种叶酸衍生物；5)叶酸定量测定。采用本发明的方法可以快速、灵敏、批量、同步测量低含量叶酸的植物叶片的总叶酸及七种叶酸衍生物含量。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105181829
【申请号】CN201510527402
【发明人】杨肖娥, 杨倩颖, 玛德·加海德·伊斯拉姆·舒哈格, 韦燕燕
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月25日