10 3X 100g/ 植物叶片重量（g)
[0076] 4) 5, 10-次甲基四氢叶酸含量（μ g/100g) = 5, 10-次甲基四氢叶酸（ng/ mL) X 12 (mL) X 10 3X 100g/ 植物叶片重量（g)
[0077] 5)10-甲酰-叶酸含量（yg/100g) = 10-甲酰-叶酸（ng/ mL) X 12 (mL) X 10 3X 100g/ 植物叶片重量（g)
[0078] 6) 10-甲酰-四氢叶酸含量（μ g/100g) = 10-甲酰-四氢叶酸（ng/ mL) X 12 (mL) X 10 3X 100g/ 植物叶片重量（g)
[0079] 7)叶酸含量（μ g/100g)=叶酸（ng/mL) X 12 (mL) X 10 3X 100g/ 植物叶片重量 (g)
[0080] 8)总叶酸含量（μ g/100g) = 441. 4X (四氢叶酸含量（μ g/100g) +445. 4+5-甲 基-四氢叶酸含量Ug/l〇〇g)+459. 5+5-甲酰-四氢叶酸含量 (μ g/100g) +473. 5+5, 10-次甲基四氢叶酸含量（μ g/100g) +457. 1+10-甲酰-叶酸 含量（μ g/100g) +469. 41+10-甲酰-四氢叶酸含量（μ g/100g) +473. 44+叶酸含量 (yg/100g) +441. 4)
[0081] 注：445. 4是四氢叶酸分子量，459. 5是5-甲基-四氢叶酸分子量，473. 5是5-甲 酰-四氢叶酸分子量，457. 1是5, 10-次甲基四氢叶酸分子量，469. 41是10-甲酰-叶酸分 子量，473. 44是10-甲酰-四氢叶酸分子量，441. 4是叶酸分子量。
[0082] 实施例1.就本发明检测蔬菜叶酸标准物质CRM 485 (来自标准参考物质和方法研 究院，比利时）的试验事例说明。
[0083] 1.线性关系考察和敏感度试验
[0084] 在本发明的质谱、色谱条件下，分别选用标准叶酸衍生物溶液：四氢叶酸 (1，15, 30, 50, 75, 90, 100ng/mL)、5-甲基-四氢叶酸（1,15, 30, 50, 75, 90, IOOng/ mL)、5_ 甲酰-四氢叶酸（1，15, 30, 50, 75, 90, 100ng/mL)、5, 10-次甲基四氢叶酸 (0· 05, 0· 25, 1，15, 30, 50, 75ng/mL)、10-甲酰-叶酸（0· 05, 0· 25, 1，15, 30, 50, 75ng/ mL)、10-甲酰-四氢叶酸含量（1，15, 30, 50, 75, 90, 100ng/mL)、叶酸 (0. 05, 0. 25, 1，15, 30, 50, 75ng/mL)，进样量2 μ 1，测得峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为 纵坐标，绘制标准曲线，回归系数、斜率见表4。由表4可见，每个衍生物的回归系数R2均大 于0.99,可见回归系数良好。
[0085] 标准叶酸衍生物四氢叶酸（Ι-lOOng/mL)、5_甲基-四氢叶酸（Ι-lOOng/mL)、5_甲 酰-四氢叶酸（Ι-lOOng/mL)、5, 10-次甲基四氢叶酸（0· 05 - 75ng/mL)、10-甲酰-叶酸 (0· 05 - 75ng/mL)、10-甲酰-四氢叶酸（l-100ng/mL)、叶酸（0· 05 - 75ng/mL)以 3 倍信噪 比浓度下对应样品浓度计算四氢叶酸，5-甲基-四氢叶酸，5, 10-次甲基四氢叶酸、5-甲 酰-四氢叶酸、10-甲酰-叶酸、10-甲酰-四氢叶酸、叶酸的检测限，10倍信噪比浓度下对 应样品浓度计算四氢叶酸，5-甲基-四氢叶酸，5-甲酰-四氢叶酸、5, 10-次甲基四氢叶 酸、10-甲酰-叶酸、10-甲酰-四氢叶酸、叶酸的定量限，结果见表4。本方法测定的四氢叶 酸、5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸、5, 10-次甲基四氢叶酸、10-甲酰-叶酸、10-甲 酰-四氢叶酸、叶酸的检测限分别为〇· 03, 0· 06, 0· 10, 0· 10, 0· 07, 0· 20, 0· llng/ml，定量限 分别为 〇· 11，〇· 20, (λ 30, (λ 32, (λ 23, (λ 40, (λ 35ng/ml，可见本方法灵敏度极高。
[0086] 表4标准样品线性关系考察，检测限和定量限的测定结果
[0089] 2.精确度试验
[0090] 称取Ig蔬菜类标准物质BCR-485 (货号：BCR-485,比利时），按照"2. 1，2. 2, 2. 3" 项方法制得纯化后的植物叶片叶酸提取物，同时制备标准叶酸衍生物溶液，按照本方法的 质谱条件详见"2. 4"和色谱条件详见"2. 5"，样品进样量2 μ L，运行时间5分钟，记录主峰 峰面积，按照外标法以峰面积得到各形式叶酸衍生物的含量（ng/mL)，再按照方法"2. 6"的 公式计算四氢叶酸、5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸和总叶酸的含量（μ g/100g)，详 见表5。由于比利时标准参考物质和方法研究院认为5-甲基-四氢叶酸是蔬菜中叶酸的主 要形式，因此四氢叶酸和5-甲酰-四氢叶酸的数据并未提供。结果可见，BCR-485主要叶 酸衍生物为5-甲基-四氢叶酸，本发明的UPLC-MS/MS方法测定的BCR-485的5-甲基-四 氢叶酸和总叶酸含量在标准参考值范围内，说明本发明方法测定结果准确可靠。
[0091] 表5蔬菜类标准物质BCR-485精确度试验
[0092] CN 105181829 A 说明书 11/15 页
[0093] aHPLC测定的BCR-485中5-甲基-四氢叶酸标准参考值
[0094] b微生物测定的BCR-485总叶酸标准参考值
[0095] 3.回收率试验
[0096] 称取Ig市场购得的小白菜，按照本方法制得叶酸提取物，同时称取Ig该小白 菜，但在步骤1)添加0.05M磷酸缓冲液同时分别添加两种不同浓度的混合标样（混合 标样为七种叶酸衍生物的混合物，低浓度混合标样为〇. 5 μ g/100g，高浓度混合标样为 7. 5 μ g/100g)，其他步骤完全相同。样品按照本方法的条件进行测定，进样量为2 μ 1，检测 时间5分钟。绝对回收率=(小白菜与混合标样混合所测浓度一小白菜所测浓度添 加混合标样的浓度Χ100%，结果见表6。5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸、10-甲 酰-叶酸和叶酸的绝对回收率大于90%，而其余叶酸衍生物的回收率也大于70%，可见本 方法回收率较高，数据可靠。
[0097] 备注说明：上述添加两种不同浓度的混合标样，以低浓度为例具体为：在 500 μ L0. 05Μ磷酸缓冲液（pH = 6. 1)添加七种叶酸衍生物的混合物，从而使这七种叶酸衍 生物的浓度均为〇. 5 μ g/100g。
[0098] 表6叶酸衍生物回收率试验
[0100] 4.相对标准偏差试验
[0101] 称取Ig市场购置的小白菜，按照"2. 1，2. 2, 2. 3"项方法制得纯化后的植物叶片叶 酸提取物，加入0. 5 μ g/lOOg混合标准样品（在步骤2. 3所得的"纯化后的叶酸纯化液"中 加入七种叶酸衍生物的混合物，从而使这七种叶酸衍生物的浓度均为0. 5 μ g/100g)，6个 重复，同时制备标准叶酸衍生物溶液，按照本方法的质谱条件详见"2. 4"和色谱条件详见 "2. 5"，样品进样量2 μ L，运行时间5分钟，记录主峰峰面积，按照外标法以峰面积得到各形 式叶酸衍生物的含量（ng/mL)，再按照方法"2. 6"的公式计算四氢叶酸、5-甲基-四氢叶 酸、5-甲酰-四氢叶酸、5, 10-次甲基四氢叶酸、10-甲酰-四氢叶酸、10-甲酰-叶酸和总 叶酸的含量（μ g/l〇〇g)，记为A ;然后对这6个样品重新进样，计算得总叶酸和叶酸衍生物 含量，记为B，然后按照公式I B-A I /A计算对应叶酸衍生物的当天检测的相对标准偏差 值。当天样品检测过后，放置4°C自动进样器，24小时后重新上样，样品进样量2 μ L，运行时 间5分钟，记录主峰峰面积，按照外标法以峰面积得到各形式叶酸衍生物的含量（ng/mL)， 再按照方法"2. 6"的公式计算叶酸及叶酸衍生物含量（μ g/100g)，记为C，然后按照公式 丨C-A I /A计算对应叶酸衍生物的隔天检测相对标准偏差值。结果见表7。由表7可见， 当天检测的叶酸衍生物相对标准偏差在1. 6至4. 1 %范围内，隔天检测叶酸衍生物相对标 准偏差在2. 8至7. 8%范围内，表明样品在自动进样器中至少保持24小时稳定，说明本方法 至少可以连续检测24小时，可批量检测样品。
[0102] 表7叶酸衍生物相对标准偏差试验
[0104] 实施例1从线性关系考察，检测限和定量限、精确度试验、回收率和相对标准偏 差试验证明本方法具有灵敏度极高、精确度高、回收率高、可批量检测样品的特点。本方 法测定的叶酸衍生物最低检测限为四氢叶酸0. 03ng/ml，最高检测限为10-甲酰四氢叶酸 0. 20ng/ml，最低定量限为四氢叶酸0. llng/ml，最高定量限为10-甲酰-四氢叶酸0. 40ng/ ml，可见本方法灵敏度极高。本方法采用蔬菜类标准物质BCR-485进行精确度试验，检测的 5-甲基-四氢叶酸和总叶酸含量均在标准参考值范围内，可见本方法精确度高，结果准确 可靠。本方法5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰-四氢叶酸、10-甲酰-叶酸和叶酸的绝对回收 率大于90%，其余相对不稳定的叶酸衍生物绝对回收率也大于70%，可见本方法测定的数 据准确。本方法样品检测时间为5分钟，样品放置4°C自动进样器里至少可保持稳定24小 时，因此本方法可以批量检测样品，提尚检测效率。
[0105] 实施例2.就本发明检测市场购得的小白菜、菠菜、生菜和温室种植的水稻叶片中 总叶酸及叶酸衍生物含量试验实例说明
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