鉴别检测正常浆细胞和克隆性浆细胞的试剂盒及其应用
【专利说明】鉴别检测正常浆细胞和克隆性浆细胞的试剂盒及其应用
[0001] 本发明属于细胞表型确认过程中的专用试剂盒结构设计，具体涉及一种应用八色 抗体组合识别克隆性浆细胞表型的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 衆细胞疾病是指克隆性衆细胞（clonalplasmacells，cPCs)过度增殖并产生大 量单克隆免疫球蛋白的一组疾病，cPCs是浆细胞疾病的发病根源。免疫球蛋白固定电泳或 游离轻链检测可以帮助确定是否存在克隆性浆细胞，但无法提示其比例；如果cPCs为非分 泌型，即不合成免疫球蛋白，则无法诊断。传统的骨髓形态学方法可以识别形态异常浆细胞 或幼稚浆细胞的比例，但不能确定其克隆性。某些疾病例，如意义未明的单克隆丙种球蛋白 病、冒烟型骨髓瘤，或治疗后的多发性骨髓瘤（multiplemyeloma，丽)，骨髓中浆细胞数量 较低，且多数同时存在cPCs和正常衆细胞（normalplasmacells，nPCs)，此时通过传统的 形态学方法难以鉴别。
[0003] 多参数流式细胞仪（multiparameterflowcytometry，MFC)具有高敏感、高特异 性。利用MFC对膜抗原检测，可以判断是否存在nPCs和异常表型衆细胞（abnormalplasma cells，aPCs)并确定其比例；通过对胞衆内免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig)cKappa和 cLambda轻链检测，可进一步判断nPCs是否为多克隆、aPCs是否为单克隆，以判断是否存 在cPCs及其比例；当nPCs和aPCs同时存在且aPCs数量较低时，更显示其优越性。因此 MFC被越来越多地应用于浆细胞疾病的检查，不仅可以帮助诊断，还可以在治疗后检测微量 cPCs，对治疗效果进行评价，以便及时调整治疗方案。
[0004] 如何选择合适的抗体组合是利用MFC准确区分nPCs、aPCs和cPCs的关键。目前 文献报道多采用3-4色抗体组合，除去设门抗体，每管试管中只能检测1-2种其它抗体，若 想检测多个抗体以确定浆细胞是否异常，需重复应用设门抗体，大概需要3-5组抗体组合， 总共需要9-20个抗体；这样导致费用过高、所需标本量增大、操作费时，且灵敏度不高。而 且，4色抗体组合无法同时囊括设门抗体、胞膜抗体和针对胞浆Ig轻链的抗体，不能达到分 群设门并进一步分析克隆性的要求。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种鉴别检测正常浆细胞和克隆性浆细胞的试 剂盒及其应用，其采用8色抗体组合、借助流式细胞仪一次检测、经逐级设门即可准确区分 nPCs、aPCs和cPCs并提示表达比例，检测的敏感度高、成本低、适用范围广，具有广泛的应 用前景与临床意义。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是： 一种鉴别检测正常浆细胞和克隆性浆细胞的试剂盒，与流式细胞仪配套使用，所述试 剂盒配备针对下述物质的单克隆抗体组合：Ig K Light Chain/ Ig A Light Chain、 CD19、CD117、CD138、CD56、CD38和CD45,并依次按照下述顺序依次进行荧光素标记：FITC/ PE、PE-Cy5、PE-Cy7、APC、APC-Cy7、V450 和 V500。
[0007] 本发明还提供了一种试剂盒在制备鉴别检测正常浆细胞和克隆性浆细胞的产品 中的应用，所述应用包括：将所述试剂盒中针对⑶19、⑶117、⑶138、⑶56、⑶38和⑶45 的单克隆抗体加入至同一个装有骨髓标本的试管中；经溶红细胞、破膜处理后，加入试剂盒 中针对IgKLightChain/IgALightChain的单克隆抗体，制成待测试样；将待测试 样经流式细胞仪检测，设门分析如下： ① 建立FSC/SSC密度图，将有核细胞区域划为Rl;对Rl细胞显示⑶38/⑶138散点图， 将⑶38+⑶138+细胞划为R2 ;建立FSC/SSC散点图只显示R2门内细胞，将均一分布的细胞 划为R3 ; ② 将R3门内细胞分别建立⑶19/⑶56、⑶19/⑶45和⑶19/⑶117二维散点图，进一步 对二维散点图内集中分布的细胞设门，标记为R4和/或R5 ; ③ 对应⑶19/⑶56、⑶19/⑶45和⑶19/⑶117中R4和/或R5门内细胞分别依次建立 CD45/CD117、CD56/CD117 和CD45/CD56 的二维散点图； ④ 对应⑶19/⑶56、⑶19/⑶45和⑶19/⑶117中R4和/或R5门内细胞分别依次建立Ig kLightChain/IgALightChain二维点图，分析IgKLightChain和IgALight Chain的表达及其比值。
[0008] 采用上述单克隆抗体组合鉴别检测正常浆细胞和克隆性浆细胞的原理如下：nPCs 的表型是受基因严格控制的，其表型具有一致性和可重复性；nPCs强表达⑶38(⑶38st)和 CD138,同时表达CD19和CD45,不表达CD117和CD56,其胞浆Ig轻链cKappa和cLambda为 多克隆性，即cKappa与cLambda的比值在0. 3-3. 0之间。aPCs是指衆细胞抗原表达出现异 常，如⑶38的强度比nPCs减弱、⑶19和⑶45变为阴性，或者异常表达⑶56、⑶117、⑶28、 ⑶33等；出现上述这些抗原的表达异常，可定义为aPCs。但aPCs是否为克隆性，还需要进 一步检测cKappa和cLambda。如果aPCs只表达ckappa或cLambda-种轻链，为轻链限制 性表达，可确定为cPCs;如果ckappa和cLambda比值在正常范围内，则为多克隆，不支持诊 断。
[0009] 因此，本发明设计了一组八色抗体组合，采用逐级设门方法确定cPCs。采用本发明 的试剂盒可检测所有浆细胞，通过同时检测膜抗原和胞浆Ig轻链以及精确设门，能够有效 区分nPCs和cPCs，检测的敏感度为0. 01%。
[0010] 以多发性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM)患者为例，采用本发明的试剂盒、借助八 色流式细胞仪检测初诊和治疗后MM患者骨髓浆细胞上的抗原表达，结果发现：几乎所有患 者均表达⑶38和⑶138,采用⑶38/⑶138散点图对浆细胞设门，根据异常抗原的表达进一 步设门后分析浆细胞的克隆性适用于所有患者；本发明的试剂盒，同时检测胞膜抗原和胞 浆Ig轻链以确定其克隆性，能够有效区分nPCs和cPCs，适用于所有初诊和治疗后MM患者； 检测敏感度可达〇. 01%。
[0011] 采用上述技术方案产生的有益效果在于：（1)本发明的试剂盒在识别所有CPCs 的应用中，具有准确率高、分析快速、方法简单的优势，为cPCs的表型分类提供了一种可靠 的新的荧光标记的单克隆抗体组合；（2)本发明试剂盒的应用能够识别所有浆细胞，检测 cPCs的敏感度为0. 01%，有助于诊断并进行疗效判定；（3)本发明采用一组包含八个单抗的 八色组合，识别浆细胞准确、可靠，同时减少了设门抗体的重复使用，减低患者和国家的经 济负担，而且简化了抗体的标记过程，便于检测的标准化和规范化，具有广泛的应用前景与 临床意义；（4)本发明的方法简单、可靠，检测敏感度可达0. 01%，易于推广。
【附图说明】
[0012] 图IA-D是采用本发明试剂盒对丽患者nPCs、aPCs和cPCs的设门分析方法； 图2是初诊MM患者浆细胞抗原表达的阳性比例。
【具体实施方式】
[0013] 鉴别检测正常浆细胞和克隆性浆细胞的试剂盒，与流式细胞仪配套使用，其特 征在于所述试剂盒配备针对下述物质的单克隆抗体组合：Ig,KLightChain/Ig,入LightChain、⑶19、⑶117、⑶138、⑶56、⑶38和⑶45,并依次按照下述顺序依次进行荧光 素标记：FITC/PE、PE-Cy5、PE-Cy7、APC、APC-Cy7、V450和V500。各单克隆抗体的荧光素标 记及成分等信息参见表1。
[0014] 表1流式单克隆抗体信息
所述试剂盒中还包括红细胞溶解液（10X，货号：555899,BD公司）、固定/破膜剂(货 号：GAS006,Multisciences公司，包括A液20ml和B液20ml，A液为细胞固定液，作用 为固定细胞；B液为破膜液，使抗体顺利进入胞内，并使细胞形态仍然保存完整）和pH为 7. 2~7. 4的10XPBS缓冲液。采用本发明的试剂盒对患者骨髓浆细胞表型测定的步骤如下： 步骤一、试剂的制备 1. 1、将10XPBS缓冲溶液稀释为IXPBS备用。
[0015] 所述10XPBS缓冲液的配制方法： Na2HPO4 ?