一体化样品预处理装置及方法
【专利说明】一体化样品预处理装置及方法
[0001]本发明为分案申请，其母案的申请号为201210244790.9，申请日为2012年7月12日且发明名称为“一体化样品预处理装置及方法”。
[0002]相关申请的交叉引用
本申请请求享有2011年7月13日提交的序列号为61/507,240的美国临时申请和2012年5月18日提交的序列号为61/648，631的美国临时申请的优先权，两个申请的公开内容通过引用并入到本文中。
技术领域
[0003]本发明涉及一体化样品预处理装置及方法。
【背景技术】
[0004]离心过滤器可用于为了浓缩、脱盐、纯化和分馏的目的而分离生物物质，如抗体酶、核酸和蛋白质。这些装置最常用在离心分离器仪器中，离心分离器仪器可由固定角转子构造或摆动角转子构造或可变角转子构造构成。过滤过程的速度和滞留物样品的回收对于用户而言非常有价值。通过除去膜囊(持样器)且使样品在收纳管中反向转动，通常会获得高于85%的样品回收值。
[0005]这些装置通常用于浓缩尿液、血清、血浆和脑脊髓液。例如，尿液中的特定蛋白质的测量结果对于各种疾病状态的诊断和处理可能很重要，但尿液中的这些蛋白质的含量通常很小而不能在没有首先浓缩蛋白质的情况下检测出。常规装置大体上包括壳体，壳体具有样品储槽；过滤器，过滤器密封在壳体中，以便样品在受到驱动力(如，离心作用)时必须穿过过滤器；以及用于收集浓缩样品的收集室。
[0006]存在一类蛋白质纯化规程，该规程使用抗原-蛋白质亲和来将相关的蛋白质从混合样品(如细胞溶解产物或血清)分离。该规程通常使用较小珠粒，珠粒与抗体共轭，使得它们结合至来自于样品的特定蛋白质。一旦蛋白质有效地结合到珠粒上，则需要从珠粒中提取和收集蛋白质(抽提物)来用于下游的分析、化验研究等。示例性的下游分析技术包括2D凝胶电泳和质谱分析。
[0007]存在在工艺流程中需要的大量处理步骤。这些步骤可包括在结合之前使珠粒与中性缓冲剂平衡、在结合之后清洗珠粒来除去未结合的污染物、抽提相关的蛋白质、从抽提出的蛋白质中交换缓冲剂、浓缩最终稀释的样品以及最后回收纯化的蛋白质样品。对于亲和纯化和免疫沉淀规程，结合到珠粒上的蛋白质是相关的蛋白质。对于去除规程，未结合的部分(未结合至珠粒的蛋白质)为相关的样品。
[0008]在这些纯化方法中使用的珠粒为磁性的或非磁性的。一种最常用的非磁性珠粒为琼脂糖。磁性珠粒是可从EMD Millipore市售获得，如用于从血清中进行蛋白和IgG去除的PureProteome蛋白质A&G、PureProteome白蛋白和PureProteome白蛋白和IgG，用于染色体免疫沉淀的Magna ChIP蛋白质A珠粒以及用于His标记重组纯化的PureProteome镍磁性珠粒。
[0009]当用磁性珠粒工作时，当前人工方法依靠使用移液管来往返于样品管(缓冲剂等)移动液体，且将样品从一个装置移动至另一个。磁铁用于将珠粒保持在样品管的一侧，以便使用者可在不干扰珠粒的情况下吸出缓冲剂。在通常的结合/清洗/抽提工艺流程中，每个样品有大约8个移液步骤。
[0010]对于与珠粒结合的最佳蛋白质，对这些方法需要孵育。包含珠粒和样品的装置通常在立式圆筒形混合机中转动10至30分钟，或放置在振荡器(例如，漩涡振荡器)中振荡10至30分钟。当添加新缓冲剂如清洗缓冲剂和抽提缓冲剂时，使用者将使装置旋动一分钟左右来混合和清洗。
[0011]清洗和抽提步骤需要重复若干次，以便有效。例如，标准规程在于将清洗缓冲剂加至样品瓶，旋动(混合)一分钟左右，除去缓冲剂且重复两次或多次。在磁性珠粒的情况下，结合/清洗/抽提过程花费大约45分钟。
[0012]磁性珠粒的备选方案为琼脂糖珠粒。使用琼脂糖珠粒的一种可市售获得的装置包括带有开口底部和定位在开口底部上的多孔玻璃料(porous frit)的管。台式离心机用于驱动流体穿过玻璃料且进入收集管(通常地为4mL或15mL的管)中，从而代替使用移液管从样品管除去流体。玻璃料的孔径选择成用以保持珠粒，同时允许缓冲剂和蛋白质穿过。
[0013]取决于使用的转动柱的尺寸，该工艺流程相比于使用磁性珠粒的方法可能很麻烦且耗时。台式离心机通常为定位在公共场所处的设备的共用件；这不同于各使用者可在其工作区域处已经摆放的微离心机。
[0014]该过程需要每个样品有16个移液步骤，且花费大约1小时来完成。
[0015]对于磁性工艺流程和琼脂糖工艺流程两者而言，下游步骤可包括交换载体缓冲剂和浓缩稀释的样品。在期望样品的缓冲剂交换，或许用以除去抽提物(如咪唑)的情况下，通常用夹具等将样品转移至透析膜管，当通过扩散的方式逐渐地交换缓冲剂时，透析膜管然后就放置在交换缓冲剂的槽内达到24小时。
[0016]在期望缓冲剂交换和浓缩的情况下，可使用透析过滤/蛋白质浓缩装置，如带有多孔UF膜的离心装置，多孔UF膜的尺寸确定为用以保持蛋白质，但允许缓冲剂穿过。通过控制转动时间和选择适合的装置设计，可控制最终浓度。为了使缓冲剂交换有效，缓冲剂交换步骤需要重复两次或三次(像用清洗步骤和抽提步骤完成的那样)。这些装置花费30至45分钟，且需要在离心机中进行若干次转动。在可由EMD Millipore市售获得的AmiconUltra装置中，有5个移液步骤用于缓冲剂交换和浓缩。
[0017]当蛋白质样品的体积变得较小时，由装置内的滞留体积造成的不期望的样品的潜在损失已经变得比平常更重要。当前数据间接表明50 μ L的浓缩样品中的10 μ L的损失表示80%的蛋白质回收。如果蛋白质损失从10 yL至1 μπι减小了一个数量级，则蛋白质样品回收可从80%增大至98%。蛋白质样品回收中的18%的改善可能很有价值。
[0018]将期望的是，提供一种装置和方法，该装置和方法高效地且有效地执行结合和清洗、缓冲剂交换和浓缩和/或在单个装置中进行完整的结合、清洗和抽提、缓冲剂交换和浓缩，而不需要移液管在装置之间转移贵重的样品，特别是对于大小达到大约llmL的样品。
【发明内容】
[0019]通过本文公开的实施例已经克服了现有技术的问题，在某些实施例中，本文包括一种样品预处理装置，该样品预处理装置允许结合和清洗、缓冲剂交换和浓缩，和/或在没有在若干装置之间转移样品的情况下执行完整的结合、清洗、抽提、缓冲剂交换和浓缩过程。根据某些实施例，提供了一种离心装置，其包括储槽，储槽具有入口、用于保持介质(如珠粒填充床)的柱、用于以密封关系收纳过滤装置的支座区以及出口。根据某些实施例，过滤装置包括具有样品储槽的壳体、设置在壳体中的一个或多个(优选两个)大致垂直地定向的膜(在存在一个以上的情况下间隔开)、与各膜相关联的暗沟，使得穿过各膜的流体流过相应的暗沟进入滤液收集室中。过滤装置插入离心装置的支座区中，且该组件可放置在可选的支座中。具有或没有可选的支座的组件可放置在用于离心作用的常规离心管中。可在没有任何移液管转移(和相关样品损失)的情况下用该装置执行整个结合、清洗、抽提、缓冲剂交换和浓缩步骤，从而导致较好的相关样品的回收。该样品预处理装置还可用于结合和清洗步骤，在此情况下，不需要过滤装置，且该样品预处理装置还可用于缓冲剂交换和浓缩步骤，在此情况下，不需要介质。可在相同的装置中执行若干次缓冲剂交换。
[0020]根据某些实施例，该装置可包括可收缩的供给管，以便有助于减少累积在供给管的内部润湿开孔和外表面上的样品溶液的损失。
[0021]根据某些实施例，样品与介质在装置中的适当位置上进行孵育，以便所选择的目标结合到介质上。然后，可清洗掉剩余的未结合的样品。通过添加缓冲剂从介质中抽提相关的目标样品来使样品纯化，缓冲剂导致介质将获取的目标释放回溶液中。一旦纯化样品，则样品可浓缩成可使用的浓度来用于分析或储存(大多数蛋白质在接近lmg/ml的浓度下储存时最稳定)。
[0022]根据某些实施例，样品预处理装置可包括偏压部件或隔膜，可促动偏压部件或隔膜来从装置中抽出较小数量(value)的样品(例如，滞留体积)。
[0023]该样品预处理装置导致用于结合和清洗、缓冲剂交换和/或结合、清洗、抽提和浓缩规程的总体时间的节省。不需要样品移液，从而导致较高的样品回收。利用用于各缓冲剂交换和清洗步骤的单个离心机转动步骤，而非先前需要的若干次转动步骤，缓冲剂交换就可在大致可能比先前少的时间内执行。不需要结合孵育周期。
[0024]根据某些实施例，过滤装置与交换室之间的组装界面可允许相对的移动或分离，如通过机械构件(如物理止挡件)或通过自促动几何结构，自促动几何结构受到离心压力梯度来除去与获取的目标接合的末梢来优化样品回收。
[0025]用所公开的装置和方法实现的优点包括但不限于缩短用于亲和分离过程的孵育时间；改善一个装置平台中的样品浓缩；改善使用反转转动出离心装置的样品回收；以及改善单次转动缓冲剂交换稀释。
【附图说明】
[0026]图1为根据某些实施例的储槽/交换部件的截面形式的透视图；
图1B为根据某些实施例的包含预先填充珠粒柱的储槽/交换部件的截面形式的透视图；
图2为根据某些实施例的储槽/交换部件和过滤装置