用于评价化学心脏毒性的免标记方法

用于评价化学心脏毒性的免标记方法
【专利说明】
[0001] 待审美国申请的交叉参考
[0002] 本申请涉及共同拥有并转让的在2008年11月25日提交的美国临时申请系列号 61/117838和在2008年11月11日提交的美国临时申请系列号12/613, 966,标题为"肝细 胞毒性试验"，现在为美国专利公开号20100129854,但不请求其优先权。此文件的内容以及 本文提到的出版物或专利文件的所有内容都通过参考结合入本文中。本申请要求2012年 11月15日提交的美国专利申请号61/726620的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及免标记的共振波导光栅（RWG)生物传感器设备和方法，以评估，例如， 心脏生物学或药物诱导的心脏毒性。
[0004] 背景
[0005] 在人和动物中，药物诱导的副作用是已知的并且在很大程度上与主要器官如心 脏、肝脏和肾脏的功能障碍相关。潜在的不良药物影响增加了安全治疗应用复杂性水平。 类似于肝毒性，对心脏毒性的评估是药物发现和药物开发过程的重要部分。药物诱导的心 脏毒性是与某些药物（包括一些用于治疗血液和实体恶性肿瘤的化疗剂）相关的不良事 件，并且通常导致发病和高死亡率。在过去的十年中，多种生物化学、细胞和组织研究已经 表明药物诱导的心脏异常与如下因素的活性变化相关，例如，离子通道、肌细胞结构、胞外 基质（ECM)结构和神经体液系统。药物心脏毒性也可导致与Ca2+相关的蛋白质异常和信号 传导系统异常。在这些因素中，离子通道活性的变化已经被认为是药物诱导的心脏毒性的 主要原因。多种重叠的离子流调节心室动作电位持续的持续时间和形态。Na+通过选择性 钠通道快速进入引发了心室的去极化。这之后是通过瞬时激活和钾通道外向失活的快速再 极化，并且随后是平台期，主要由钙离子通过L-型钙通道进入来确定。在再极化期间，由钙 通道的失活以及主要由延时整流钾通道的慢速和快速型组分（rapidcomponent)携载的净 向外钾离子流的增加使带负电的跨膜电位恢复。内向整流钾通道也导致再极化。包括Na+/ Κ+_栗的调节因子使胞内离子浓度恢复至初始状态。
[0006] 对药物心脏毒性的评价对于新型药物的安全开发是重要的。在美国，几乎所有新 药的批准之前，评价化合物使体表心电图QT间隔延长的风险以及威胁生命的心律失常的 风险是一项FDA(美国食品和药品管理局）的规定。QT间隔是心脏电周期中，Q波起始和Τ 波结束之间的时间测量值。通常，QT间隔表示左右心室的电去极化和再极化。延长的QT间 隔是心室快速性心律失常，如尖端扭转型室性心动过速（TdP)的生物指标，并且是猝死的 风险因素。QT延长最常见与通过hERG(人ether-a-go-go相关基因）钾离子通道的电流 损失相关，该损失是由于药物或通道蛋白的质膜表达的抑制偶然导致的离子通道的直接堵 塞。在大多数的情况中，延长QT间隔的药物优先抑制编码IKr通道的α-亚基的基因hERG 或延迟整流钾离子流通道（I(Kr))的快速型组分。
[0007] 公认的体内药物心脏毒性评价方法是心电图（ECG)测试。表面ECG提供了关于电 活动的信息，包括心脏内的心房/心室去极化和心室再极化。在ECG中，QT间隔表示心室 去极化（即，跨膜电位的降低）和再极化（即，静息电位的恢复）。ECG代表心室动作电位 的持续时间并且包括QT间隔，该间隔反映了两个心室的活化时间。虽然，大多数药物诱导 的QT延长与hERG的抑制相关，但还没有决定性地证明hERG通道的抑制导致长QT间隔的 反向关联。另外，离子栗活性变化和心肌细胞死亡也可能产生心脏毒性。药物诱导的不利 风险的早期鉴定有益于在分子水平上评价多重离子通道、细胞增殖和细胞死亡。心脏毒性 测试已成为药物开发的核心部分。
[0008] 存在用于药物诱导的心脏毒性的体外评价的若干其他技术，包括使用hERG转染 细胞或分离的心肌细胞的膜片钳技术、Rb+流出试验、使用浦肯野（Purkinje)纤维或豚鼠 乳头肌的微电极试验，和基于生物阻抗的心肌细胞分析。其中，膜片钳技术可能是筛选药物 诱导的心脏毒性的最广泛使用的工具，其允许监测单一药物对单一目标离子通道的一次作 用。虽然这种技术证明了高准确性，但是其不允许同时观察多个离子通道活性，并且不允许 系统性展示药物心脏毒性，包括细胞死亡和细胞信号传导中的变化。大多数其他可行技术 与细胞群的平均测量值相关。整合单细胞生物学和心血管细胞群体的表现的免标记的全细 胞试验方法将会是高度有利的。

【发明内容】

[0009] 本发明提供了高频率免标记共振波导光栅（RWG)生物传感器成像系统和方法，用 于测量在存在和不存在化学物质（如药物分子）的情况中培养的心肌细胞的动态质量再分 布（DMR)和搏动图。免标记设备和方法使用共振波导光栅生物传感器的高频率扫频波长解 调来检测培养的心肌细胞的搏动图。在实施方式中，本发明也提供了评估药物诱导心脏毒 性的潜力的数据分析方法。
【附图说明】
[0010] 在实施方式中：
[0011] 图1显示了在具有培养的人iPS-衍生的心肌细胞的EPIC? 384孔微板中的共振 波导光栅生物传感器3x4阵列的伪彩色高分辨共振波长图像。图2是显示在具有培养的人 iPS-衍生的心肌细胞的RWG生物传感器的各像素处的基底共振波长的分布。
[0012] 图3A和3B各自显示由分析缓冲液（即阴性对照（图3A))和160nM异丙肾上腺 素（图3B)诱导的培养的人iPS-衍生的心肌细胞的动态质量再分布信号。
[0013] 图4是显示具有培养的人iPS-衍生的心肌细胞的RWG生物传感器的平均共振峰。 图5是在EP丨C_? 384孔微板中RWG生物传感器的3x4阵列的伪彩色共振光强度图。
[0014] 图6从左到右显示了具有静息状态下的培养的人iPS-衍生的心肌细胞的RWG生 物传感器的0至27秒的时间序列的伪彩色共振光强度图。图7显示培养的人iPS-衍生 的心肌细胞搏动的典型搏动图和关键参数，包括：上升时间、松弛时间，和定义搏动图的强 度％或搏动强度。
[0015] 图8提供了一系列示例图（A至F)，其显示培养的人iPS-衍生的心肌细胞在接触 前（基线；左列）的搏动图和在接触或用特定药物分子刺激之后随时间的测量结果（参见 搏动强度％对比时间插图）中的时间依赖性变化。图9提供了显示不同剂量的西沙必利 (cisapride)对培养的心肌细胞搏动的作用的系列图（a到1):刺激前的心肌细胞的搏动； 和在用不同剂量的西沙必利处理后15分钟时相应的心肌细胞的搏动。
[0016] 图10A和10B显示了伊莎帕定（israpadine)诱导的培养的心肌细胞的搏动率的 时间和剂量依赖的变化图。显示了两个独立重复实验的结果（左和右）。
[0017] 图11A和11B显示伊莎帕定诱导的培养的心肌细胞的搏动强度的时间和剂量依赖 的变化图。显示了两个独立重复实验的结果（左和右）。
[0018] 详细描述
[0019] 下面参考附图（如果有的话）详细描述本发明的各种实施方式。参考各种实施方 式不限制本发明的范围，本发明范围仅受所附权利要求书的范围限制。此外，在本说明书中 列出的任何实施例都不是限制性的，且仅列出要求保护的本发明的诸多可能的实施方式中 的一些实施方式。
[0020] 在一些实施方式中，所揭示的设备以及制造和使用方法提供了一个或多个优势特 征或方面，包括例如，如下文所述。在任何权利要求中列出的特征或方面通常可应用于本发 明的所有方面。在任一项权利要求中所述的任何单个或多个特征或方面可以结合或与任一 项或多项其它权利要求中所述的任何其它特征或方面置换。
[0021] 定义
[0022] "中心共振波长"是指提供照射光进入波导光栅生物传感器的最大耦合效率的波 长。
[0023] "包括"、"包含"或类似术语意为包括但不限于，即内含而非排它。
[0024] 在描述本发明实施方式时用来修饰例如组合物中成分的量、浓度、结构尺寸、体 积、处理温度、处理时间、产率、流速、压力、粘度等数值及它们的范围的"约"指的是数量的 变化，可发生在例如：制备化合物、组合物、复合物、浓缩物或应用制剂的典型测定和处理步 骤中；这些步骤中的无意误差；制造、来源或用来实施所述方法的原料或成分的纯度方面 的差异中；以及类似考虑因素中。术语"约"还包括由于组合物或制剂的老化而与特定的初 始浓度或混合物不同的量，以及由于混合或加工组合物或制剂而与特定的初始浓度或混合 物不同的量。
[0025] 除非另外说明，否则，本文所用的不定冠词"一个"或"一种"及其相应的定冠词 "该"表示至少一（个/种），或者一（个/种）或多（个/种）。
[0026] 可采用本领域普通技术人员熟知的缩写（例如，表示小时的"h"或"hr"，表示克的 "g"或"gm"，表示毫升的"mL"，表示室温的"rt"，表示纳米的"nm"以及类似缩写）。
[0027] 结构、组分、成分、添加剂和类似方面的公开的具体和优选数值及其范围仅用于说 明，它们不排除其它定义的数值或所定义的范围内的其它数值。本发明的方法可包括任何 数值或数值、具体数值、更具体的数值和优选数值的任何组合，包括中间值和范围。
[0028] 细胞的体外培养提供了可用于药理学、生理学和毒理学研究的材料。药物筛选技 术中的近期进展使药物公司能针对治疗靶标快速筛选庞大的化合物库。
[0029] 心脏毒性是可能导致心肌损伤的情况。药物诱导的心脏毒性是指通过药物影响心 脏的心脏毒性，并且包括药物对心脏的直接作用，但也可包括间接作用，例如，由于血液动 力流变化的增强或由于血栓事件。严重的心脏毒性可导致心肌病。心肌病常因治疗（如化 疗治疗法）所致，或者可以是由一组可造成损伤的心肌的疾病或病症导致。心肌损伤可造 成心脏栗送作用紊乱，并随后导致心力衰竭。
[0030] 药物诱导的心脏毒性通常导致左心室功能障碍、节律紊乱和缺血。这些毒性作用 可从亚临床异常到威胁生命的状态。这些作用可能与药物接触或医疗相关，但也可能与长 期心血管作用相关。通常可能会导致心脏毒性或心肌病的药疗法包括，例如，蒽环类药物。 包括多柔比星在内的蒽环类药物可用于治疗白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、肉瘤 和其他癌症。多柔比星相关的心脏毒性（AAC)已被长期公认，并且可分成三种形式：即期心 包炎-心肌炎综合征、早发慢性进行性形式和晚发慢性进行性形式。AAC的潜在机制的主要 假设是反应性自由基物质的生成，所述物质与细胞膜相互作用并破坏细胞膜。其他可能的 机制包括，例如，诱导凋亡、线粒体DNA破坏、ATP生成的变化和肌浆网钙ATP酶的mRNA表 达下调。
[0031] 在过去的数十年中，新药的开发已经揭示了药物，尤其是抗癌药的致心律失常作 用新谱，