用于测量凝血细胞功能的方法
【专利说明】用于测量凝血细胞功能的方法
[0001]本发明涉及用于测量凝血细胞功能的方法。
[0002]在人类医学和兽医学领域都有对凝血细胞功能检测的需求，凝血细胞功能检测可以诊断凝血细胞(血小板)和止血功能的障碍和监控抗凝治疗，在这种情况下可以是预测更可靠的和成本更有效的，此外可以在临床实验室以外使用。目前可用的凝血细胞功能检测是测量静态条件下凝血细胞群体(几百万凝血细胞)对激动剂的反应应答。所述反应应答不反映精确分配旁分泌信号的体内条件，甚至不考察不同凝血细胞之间功能能力(例如灵敏度)的固有差异，尤其是考虑超敏感的凝血细胞。
[0003]光透射聚集是在凝血细胞功能检测时的所谓的“黄金标准”，而由于影响精确度的各种因素，阻抗集合度没有被广泛使用。目前，所有凝血细胞检测分析凝血细胞群体对激动剂(刺激物)的应答，但没有给出在单个凝血细胞水平上的任何信息。
[0004]由W0 2007/008064 A2已知具有微流体室的自由流电泳系统，如在自由流电泳系统中充分已知的，其用于将颗粒根据它们的电荷互相分离和进行分析，任选地，在下游的检测单元中继续影响如此分离的颗粒。
[0005]由W0 2013/013228 A1已知一种方法，所述方法首先用于研究事先给药的患者的血液样品，以便检验药物的有效性。或者还可以提出，不将这类药物或相应的物质事先给予患者，而直接添加至血液样品并且随后进行相应的检测。随后，在药物或相应的物质对血液样品进行作用之后，将样品引入电场中，借助电场中的不同偏移来区分活化的和未活化的凝血细胞。
[0006]由US 7 138 269 B2已知用于表征颗粒和血细胞的微流体系统，可以在所述系统中应用电场，从而通过微流体系统中不同的运动来识别不同电荷的颗粒，其中可以独立地检验单个颗粒。在此过程中，在检验之前将试剂加入含有颗粒的待检验的溶液中。
[0007]本发明的目的在于，提供一种解决方案，借助于所述方案可以采用尽量少的设备耗费高通量地测量单个凝血细胞的灵敏度。
[0008]所述目的根据本发明以开篇所述类型的方法由此实现:将其中凝血细胞分散存在的液态凝血细胞溶液引入微流体室，在所述微流体室上施加横跨凝血细胞溶液进入方向指向的电场，并在电场作用之前立即或在电场作用期间与至少一种刺激物接触，并观察和评估凝血细胞在电场中的运动轨迹，如此，将运动轨迹朝向电场的负极方向指向的凝血细胞归类为活化的凝血细胞，且将运动轨迹朝向电场的正极方向指向的凝血细胞归类为未活化的凝血细胞。
[0009]本发明提供了一种方法，利用所述方法可以采用尽量少的设备耗费高通量地测量单个凝血细胞的灵敏度。为此将其中凝血细胞分散存在的凝血细胞溶液，即例如大量稀释的凝血细胞溶液在电场作用之前立即或在电场作用期间与对凝血细胞起作用的刺激物合并到一起。根据刺激物(激动剂)的有效性以已知的方式改变单个凝血细胞的表面，并因此改变其电荷状态。已知的是，未活化的凝血细胞的表面电荷是负的，且活化的凝血细胞的表面电荷是较少负的至正的。根据由刺激物对各个凝血细胞的发生活化或不发生的活化(在使用活化剂作为刺激物的情况下)，改变单个凝血细胞在电场中的运动轨迹，这可以以简单的方式用显微镜观察到。同样地，在使用抑制剂作为刺激物时，通过观察凝血细胞的运动轨迹来检验抑制剂对各个凝血细胞的有效性。根据运动轨迹的走向可以以简单的方式对凝血细胞进行归类。微流体室内的电场因此不用于(颗粒-)分离，而是评估运动轨迹的变化，并在电场的作用之前立即或在电场作用期间将颗粒(凝血细胞)与刺激物混合。
[0010]在特别优选的实施方案中提出，所述凝血细胞溶液首先与第一刺激物接触，随后在室中在下游与第二刺激物接触。此外，所述第一刺激物优选是活化剂和第二刺激物优选是抑制剂。
[0011]在优选的其它实施方案中提出，将所述液态凝血细胞溶液引入微流体自由流电泳室中。
[0012]所述凝血细胞溶液与刺激物的合并或混合可以不同方式进行。
[0013]根据第一实施方案提出，所述液态凝血细胞溶液首先与刺激物溶液合并，且随后将混合的凝血细胞-刺激物溶液引入微流体室中。在该实施方案中，所述混合因此在引入微流体室之肖U立即完成。
[0014]根据第二实施方案提出，所述液态凝血细胞溶液和刺激物溶液平行地引入微流体室中。所述混合随后才在电场的有效区域中进行。
[0015]最后，作为选择地提出，在将凝血细胞溶液引入微流体室之前将刺激物颗粒固定在室的底板上。所述凝血细胞溶液和因此的凝血细胞与固定地布置在室中的刺激物颗粒接触。在室的底板上的固定还特别好地适用于凝血细胞与第二刺激物接触。
[0016]在本发明意义上，刺激物溶液应理解为不仅是溶液本身，还有其中存在未溶解的刺激物颗粒的悬浮液。
[0017]作为刺激物基本上可以使用所有已知和适合于凝血细胞处理的那些，优选使用二磷酸腺苷、胶原、凝血酶或前列腺素作为活化剂，和使用乙酰水杨酸、惊厥蛋白(Convulxin)、氯卩比格雷(Clopidogrel)、普拉格雷(Prasugrel)、替格雷洛(Tieagre 1 or)、前列环素(Prostacyclin)作为抑制剂。
[0018]作为所述凝血细胞溶液中用于凝血细胞的流体载体介质，可以使用例如Hepes缓冲液。
[0019]为了评估凝血细胞的运动轨迹，根据第一实施方案优选提出，借助于成像方法或光学检测方法使室中的凝血细胞的运动轨迹成像。
[0020]微流体室中的电场可以借助于直流电压或借助于脉冲直流电压来产生。用于产生电场的电极可以布置在微流体室内。所述电极可以是微细加工的电极(mikrofabrizierteElektrode)或丝状电极。所述电极可以例如由金、铂、石墨或可以压印在透明基材，例如玻璃或聚甲基丙烯酸甲酯上的其它导电材料构成，或者是由这些材料制备的丝状的电极。
[0021]所述电极在微流体室内部被通过边界区域(例如电解质桥)与实际的流动通道隔开，所述边界区域可以由聚合物基质如水凝胶或类似的材料形成，或者体现为一系列微通道。
[0022]以下借助附图示例性地详细阐述本发明。
[0023]图1显示了未活化的和活化的凝血细胞的主要表面的示意图；
[0024]图2显示了凝血细胞引入的第一实施方案的自由流电泳室的俯视图；
[0025]图3显示了引入溶液中的第二实施方案的自由流电泳室的俯视图，和
[0026]图4显示了凝血细胞引入的第三实施方案的自由流电泳室的侧视图。
[0027]在图1中以放大的比例用TNA来表示未活化的圆形构成的凝血细胞。所述未活化的凝血细胞TNA在其表面01上具有负的表面电荷。
[0028]如果将这些未活化的凝血细胞TNA通过刺激物或激动剂活化(这由箭头Pf象征性地表示)，则活化的凝血细胞TA采取另一种，即不规则的表面结构，且膜成分在凝血细胞膜内以另一种方式布置，使得活化的凝血细胞1\的表面02上的电荷为较少负的至正的。未活化的凝血细胞TNA和活化的凝血细胞T A的这种不同的表面电荷分布对根据本方面的方法而目是有用的。
[0029]在图2中示出了自由流电泳室1形式的微流体室，在其上横跨室1的纵向延伸的主流