设备，实现定量检测。同时，可在同一试纸条上检测两种或两种以上的肿瘤标志物，实现量子点免疫层析试纸条对肿瘤标志物的多元定量检测，大大简化了操作步骤，检测快速，操作简单无需专业人士，降低了检测成本，提高了肿瘤检测的准确性。
[0022]以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
【附图说明】
[0023]图1是本发明一个较佳实施例中的免疫层析试纸条的示意图；其中1、样品2、样品垫3、结合垫4、硝酸纤维素膜5、检测线T16、检测线T2 7、质控线8、吸水垫9、背衬板。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图和实施例对发明做进一步的描述。
[0025]基于量子点的肺癌标志物NSE和CEA的联合检测试纸条的制备:
[0026]步骤一:量子点免疫荧光探针的制备
[0027]将0.5毫升量子点置于0.5毫升腿3(2-0-吗啉)乙磺酸)溶液(0.0111101，？册.0)中，混合均勾。再在混合液中加入EDC和NHS，室温下反应30分钟后离心，得到表面羧基活化后的量子点，将其分别与NSE单克隆抗体(鼠抗NSE单克隆抗体L1C00502)和CEA单克隆抗体(鼠抗CEA单克隆抗体L1C00202)置于I XI3BS(磷酸盐缓冲液，pH 7.4)中，17°C下反应3小时后离心，再加入含有1.5 % BSA的I XI3BS缓冲液(pH7.4)封闭量子点上未反应的羧基，反应I小时后即得到抗NSE免疫荧光探针和抗CEA免疫荧光探针。
[0028]上述反应中:量子点与EDC摩尔配比为1:2000?5000，EDC与NHS的摩尔配比为2:1，量子点与标记抗体摩尔配比为1:5?10。
[0029]步骤二:样品垫2和结合垫3的制备
[0030]用样品垫处理液和结合垫处理液分别浸泡样品垫2和结合垫3并于37°C烘干，然后用上述抗NSE免疫荧光探针和抗CEA免疫荧光探针喷涂在结合垫3上并于37°C烘干，得到样品垫2和结合垫3。
[0031]上述样品垫处理液是硼酸、四硼酸钠、氯化钠、牛血清蛋白、吐温-20(聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯)的混合溶液;结合垫处理液是硼酸、四硼酸钠、蔗糖、海藻糖、吐温-20的混合溶液。
[0032]步骤三:硝酸纤维素膜4的选取及抗体的固定
[0033]硝酸纤维素膜选自商品化的Millip0rel35，孔径为8微米。
[0034]用含有2%蔗糖的I3BS缓冲液分别将NSE抗体(鼠抗NSE单克隆抗体L1C00503)、CEA抗体(鼠抗CEA单克隆抗体L1C00205)稀释至2毫克/毫升，将羊抗鼠IgG稀释至I毫克/毫升。用B1 Dot喷膜机在硝酸纤维素膜4上分别包被上述三种溶液制备出检测线T15、检测线T26及质控线7。检测线5、6上分别喷膜CEA抗体和NSE抗体或者检测线5、6上分别喷膜NSE抗体和CEA抗体，质控线7上喷膜羊抗鼠IgG，喷膜完成后放在37°C恒温干燥箱干燥I小时，封袋置于4°C保存备用。
[0035]步骤四:试纸条的组装
[0036]在背衬板9上依次粘贴样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸水垫8，相邻垫之间相互重叠约1-2毫米，组装完成后，用自动切膜机将试纸条切割为3毫米宽度，将切割好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。
[0037]本发明利用免疫层析检测方法快速便捷的优点，来检测灵敏度及特异度均较高的肺癌标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)和癌胚抗原(CEA)。在该检测方法中，检测原理为双抗夹心法，利用羧基化的量子点作为标记物，将量子点与抗NSE、CEA单克隆抗体通过羧基、氨基反应特异性的结合在一起，制备成免疫荧光探针，用来捕获样品I中的CEA和NSE。同时，在试纸条的硝酸纤维素膜4上包被另一株NSE和CEA的单克隆抗体，进而捕获层析反应过程中已经结合了NSE和CEA的量子点免疫焚光探针。而未结合的量子点免疫焚光探针，继续向吸水垫8方向上层析，在质控线7和羊抗鼠二抗发生免疫反应，并且滞留下来。层析结束待结果稳定后，借助于荧光定量检测设备对检测线和质控线进行荧光光密度分析。并根据具有系列浓度梯度的NSE和CEA标准品检测所得到的标准曲线，来得到样本中待测物质的浓度。利用本发明中免疫层析试纸条对肺癌标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)和癌胚抗原(CEA)的定性定量检测，可将其应用于肺癌的诊断，尤其是小细胞肺癌的诊断。
[0038]以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化；因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1.一种免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、检测线、质控线、吸水垫和背衬板，其特征在于，所述结合垫装载有两种免疫荧光探针，所述免疫荧光探针以量子点作为标记物，所述量子点分别与NSE抗体和CEA抗体偶联形成抗NSE免疫荧光探针和抗CEA免疫荧光探针;所述检测线有两条，一条检测线包含NSE抗体，另一条检测线包含CEA抗体。2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述抗NSE免疫荧光探针中的抗体为鼠抗NSE单克隆抗体L1C00502，所述抗CEA免疫荧光探针中的抗体为鼠抗CEA单克隆抗体 L1C00202。3.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述检测线中的所述NSE抗体为鼠抗N SE单克隆抗体LI CO O 5 O 3，所述检测线中的所述CE A抗体为鼠抗CE A单克隆抗体LlC00205o4.一种免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤: 步骤一:将量子点分别与NSE抗体和CEA抗体偶联，制备得到抗NSE免疫荧光探针和抗CEA免疫荧光探针； 步骤二:用样品垫处理液浸泡样品垫，用结合垫处理液浸泡结合垫，烘干，然后用步骤一中得到的所述抗NSE免疫荧光探针和抗CEA免疫荧光探针喷涂在所述结合垫上，烘干； 步骤三:在硝酸纤维素膜上设置两条检测线和一条质控线，其中一条检测线包被有NSE抗体，另一条检测线包被有CEA抗体，所述质控线包被有羊抗鼠二抗； 步骤四:在背衬板上依次粘贴步骤二中经处理的所述样品垫、所述结合垫，和步骤三中的所述硝酸纤维素膜，以及吸水垫;相邻垫之间相互部分重叠，组装得到所述免疫层析试纸条。5.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，羧基化的所述量子点与所述NSE抗体和所述CEA抗体通过羧基、氨基的反应进行偶联;所述NSE抗体为鼠抗NSE单克隆抗体LI C00502，所述CEA抗体为鼠抗CEA单克隆抗体LI C00202。6.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，所述样品垫处理液的组分包括硼酸、四硼酸钠、氯化钠、牛血清蛋白、吐温-20和去离子水;所述结合垫处理液的组分包括硼酸、四硼酸钠、蔗糖、海藻糖、吐温-20和去离子水。7.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，所述NSE抗体为鼠抗NSE单克隆抗体LI C00503，所述CEA抗体为鼠抗CEA单克隆抗体LI C00205。8.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，相邻垫之间相互重叠1-2毫米;将组装完成后的所述免疫层析试纸条切割为需要的宽度，与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。9.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条在诊断肺癌中的应用。10.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条在诊断小细胞肺癌中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、检测线、质控线、吸水垫和背衬板；结合垫装载有两种免疫荧光探针，其以量子点作为标记物，量子点分别与NSE抗体和CEA抗体偶联形成抗NSE免疫荧光探针和抗CEA免疫荧光探针；检测线有两条，一条检测线包含NSE抗体，另一条检测线包含CEA抗体。本发明还公开了该免疫层析试纸条的制备方法及其在诊断肺癌中的应用。本发明的免疫层析试纸条检测简单迅速、检测结果直观，可定性、半定量甚至定量检测，价格低廉，能够同时检测两种或两种以上的肿瘤标志物，实现量子点试纸条检测肿瘤标志物的多元检测。
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/574, G01N33/558
【公开号】CN105527440
【申请号】CN201511031132
【发明人】王侃, 肖琨, 崔大祥
【申请人】上海交通大学
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2015年12月31日