一种库尔勒香梨果实细胞切片立体染色方法
【技术领域】
[0001]本专利发明了一种库尔勒香梨果实切片立体染色方法，其特征是将5%苏木精无水乙醇溶液、10%三氯化铁溶液、碘-碘化钾溶液和30%过氧化氢溶液按照一定的比例混合后对常规石蜡切片法处理好的库尔勒香梨果实切片进行染色，观察表皮细胞、果肉细胞、石细胞和输导组织细胞的生长变化，研究库尔勒香梨果实内各种细胞发育过程，为库尔勒香梨施肥配方筛选，良种选育提供技术支持。
【背景技术】
[0002]库尔勒香梨是新疆的名、优、特色水果，栽培历史已有1400多年，产于新疆东南部巴州境内的孔雀河畔，主要分布在巴州地区的库尔勒市、轮台县、尉犁县和农二师28，29，30，31，32，33，34，35团场。从1995年至今，库尔勒香梨种植面积每年以0.32066万hm2的规模迅速扩展，截止2002年已达3万hm2，产量达20多万吨。随着西部大开发战略的实施和自治区农业产业结构的调整，香梨作为特色产业步入大面积发展的新阶段，到2014年香梨种植面积已经超过了 10万hm2，其种植面积和范围仍在不断扩大。随着库尔勒香梨种植面积的增大，也产生了一系列问题，尤其是农民为了追求库尔勒香梨的高产量，在种植管理过程中过多的施用化肥，有机肥施加的少，管理技术落后等原因导致了香梨石细胞比例比较大，降低了库尔勒香梨的品质。因此，需要一种快捷、简便的库尔勒香梨果实细胞染色方法，便于研究库尔勒香梨果实细胞发育过程，为库尔勒香梨栽培生产中的施肥配方筛选、管理技术改进和良种选育提供依据。目前能用于库尔勒香梨果实细胞的染色技术较少，而疆内的技术人员在对库尔勒香梨果实的研究过程中所用的方法主要是番红-固绿双重染色法，番红溶液能将库尔勒香梨果实细胞切片中木质化、栓质化和角质化的细胞染成红色，再经固绿溶液染色后，细胞壁和部分原生质被染成绿色，石细胞为紫红色至紫黑色。但番红-固绿染色方法操作比较复杂，需要经过一系列的乙醇、二甲苯梯度处理，操作时间较长，染色和脱色时间不容易把握，而且对库尔勒香梨果实的石细胞染色较重，石细胞表面结构模糊不清楚，石细胞核内结构完全看不到，果肉细胞有时被染成绿色，输导组织完全看不清楚。
【发明内容】
[0003]针对番红-固绿染色方法不能将库尔勒香梨果实内的所有细胞清楚着色的缺陷，本发明要解决的问题是提供一种操作简便的立体染色方法，能对库尔勒香梨果实细胞进行立体染色，将皮层细胞、果肉细胞、石细胞和输导组织细胞清楚着色，且彼此间区分明显。为解决上述技术问题，本发明库尔勒香梨果实细胞立体染色方法所用到的试剂主要有5%苏木精无水乙醇溶液，10%三氯化铁溶液，碘-碘化钾溶液，30%过氧化氢溶液(可直接购买得到)。试验方法如下:将5%苏木精无水乙醇溶液和30%过氧化氢溶液按照10:1的比例提前2天配好；碘-碘化钾溶液配制方法是将4g碘化钾溶解到10ml热蒸馏水中，碘化钾充分溶解后再加入1.5g碘充分溶解；10%三氯化铁水溶液配制方法是将1g三氯化铁溶解到90ml蒸馏水中。将上述配制好的3种溶液按照3:4:2的体积比例进行充分混合，半个小时候后对处理好的库尔勒香梨果实细胞切片进行染色。库尔勒香梨果实细胞切片的制作方法如下:取出FAA固定液中的样品，用50%乙醇浸洗10-20分钟，然后经50%乙醇浸泡2小时—70%乙醇浸泡2小时(可过夜保存)一80%乙醇浸泡2小时一90%乙醇浸泡2小时一95%乙醇浸泡2小时一100%乙醇浸泡I小时一100%乙醇浸泡I小时一1/2乙醇+1/2 二甲苯浸泡2小时一二甲苯浸泡I小时一二甲苯浸泡I小时一1/2 二甲苯+1/2石蜡溶液浸泡12-24小时(置于40°C恒温箱内)一干净的石蜡溶液浸泡(置于60-62°C恒温箱内)，每6个小时换一次石蜡溶液，一共更换3次一包埋一自来水浸泡12小时一修蜡块，用石蜡切片机将梨果实组织切成12_14um厚的蜡带，放到干净的载玻片上一滴水展片，40°C展片台展片1_2个小时，至蜡带完全展开一二甲苯脱蜡10分钟一1/2 二甲苯+1/2乙醇浸泡5分钟一无水乙醇浸泡3分钟一95%乙醇浸泡3分钟一90%乙醇浸泡3分钟一80%乙醇浸泡3分钟一70%乙醇浸泡3分钟一50%乙醇浸泡3分钟一30%乙醇浸泡3分钟一蒸馏水浸泡I分钟。切片染色后经脱色、脱水等处理后进行拍照观察。
[0004]本专利库尔勒香梨果实细胞立体染色法，能将库尔勒香梨果肉细胞壁染成褐色，边界清晰；原生质染成淡青色或者无色；果肉细胞核呈紫黑色；石细胞呈褐色或者黄色；输导组织染成淡褐色。能够对库尔勒香梨果实内的各种细胞清楚着色，实现了立体染色。与番红-固绿染色法相比较，本专利方法具有以下优点:1.各种细胞着色清楚，区分明显，具有立体染色效果；2.方法易于操作，染色和褪色时间容易把握，整个实验过程比番红-固绿法缩短了 I天。3.节约材料，不需要载玻片即可直接观察；4.可经无水乙醇一1/2乙醇+1/2二甲苯一二甲苯处理后，中性树胶封片制作成永久切片。
[0005]具体实施方法
1.样品固定:将库尔勒香梨各生长时期的果实切成0.6cm*0.4cm*0.3cm左右的小块，用FAA固定液固定，2天更换一次固定液，固定一个星期效果较好。如果样品需要长期保存，可将样品放在4°C冰箱内。FAA固定液配制方法是70%无水乙醇:冰乙酸:40%甲醛溶液=89:5:6。
[0006]2.试剂:5%苏木精无水乙醇，10%三氯化铁水溶液，碘-碘化钾溶液，30%过氧化氢溶液，1%三氯化铁水溶液，5%硫代硫酸钠水溶液。
[0007]3.配制方法:将5%苏木精无水乙醇溶液和30%过氧化氢溶液按照10:1的比例提前2天配好。碘-碘化钾溶液配制方法是将4g碘化钾溶解到10ml热蒸馏水中，碘化钾充分溶解后再加入碘1.5g。10%三氯化铁水溶液配制方法是将1g三氯化铁溶解到90ml蒸馏水中。将上述3种溶液按照3:4:2的比例进行配置，半个小时候后对库尔勒香梨果实细胞切片进行染色。
[0008]4.操作步骤:
(I)取出FAA固定液中的样品，用50%乙醇浸洗10-20分钟，然后经50%乙醇浸泡2小时—70%乙醇浸泡2小时(可过夜保存)一80%乙醇浸泡2小时一90%乙醇浸泡2小时一95%乙醇浸泡2小时一100%乙醇浸泡I小时一100%乙醇浸泡I小时一1/2乙醇+1/2 二甲苯浸泡2小时一二甲苯浸泡I小时一二甲苯浸泡I小时一1/2 二甲苯+1/2石蜡溶液浸泡12-24小时(置于40°C恒温箱内)一干净的石蜡溶液浸泡(置于60-62°C恒温箱内)，每6个小时换一次石蜡溶液，一共更换3次一包埋一自来水浸泡12小时一晾干,修蜡块,用石蜡切片机将梨果实组织切成12-14um厚，放到干净的载玻片上一滴水展片，40°C展片台展片1_2个小时，至蜡片完全展开一二甲苯脱蜡10分钟一1/2 二甲苯+1/2乙醇溶液浸泡5分钟一无水乙醇浸泡3分钟一95%乙醇浸泡3分钟一90%乙醇浸泡3分钟一80%乙醇浸泡3分钟一70%乙醇浸泡3分钟一50%乙醇浸泡3分钟一30%乙醇浸泡3分钟一蒸馏水浸泡I分钟。
[0009](2)用提前配制好的染色液对步骤I中处理好的切片染色20-30分钟，至颜色呈黑色。
[0010](3)用干净的蒸馏水浸泡载玻片,来回移动水中的载玻片,确保洗净载玻片上的染色液。
[0011](4)分化,根据染色程度,用1%三氯化铁水溶液浸泡30S-1 min,至石细胞显色为淡黄色至淡褐色，用自来水充分洗去氯化铁溶液，再用蒸馏水浸泡I分钟。
[0012](5)用90%乙醇急速分化I分钟，然后95%乙醇浸泡I分钟、无水乙醇浸泡I分钟。
[0013](6)光学显微镜拍照。也可经1/2乙醇+1/2 二甲苯浸泡3分钟一二甲苯浸泡5分钟一二甲苯浸泡5分钟一中性树胶封片,制作成永久切片。
【主权项】
1.一种库尔勒香梨果实细胞切片立体染色法，其特征是将2天前配制好的苏木精溶液、三氯化铁溶液和碘-碘化钾溶液按3:4:2的体积比例混合均匀，半个小时后对处理好的库尔勒香梨果实细胞切片染色，染色时间20-30分钟，再经分化、脱水处理后拍片观察，也可经二甲苯处理后制作成永久切片。2.根据权利要求1所述的苏木精溶液，其特征在于:将5%苏木精无水乙醇溶液和30%过氧化氢溶液按照10:1体积比例配制得到。3.根据权利要求1所述的碘-碘化钾溶液，其特征在于:将4g碘化钾溶解到热蒸馏水10ml中，碘化钾充分溶解后加入碘1.5g。4.根据权利要求1所述的梨果实细胞切片，其特征在于:用常规石蜡切片法将库尔勒香梨果肉组织切成12-14um厚，经二甲苯脱蜡10分钟一1/2 二甲苯+1/2乙醇浸泡5分钟—无水乙醇浸泡3分钟一95%乙醇浸泡3分钟一90%乙醇浸泡3分钟一80%乙醇浸泡3分钟一70%乙醇浸泡3分钟一50%乙醇浸泡3分钟一30%乙醇浸泡3分钟一蒸馏水浸泡I分钟得到。5.根据权利要求1所述的分化，其特征在于:根据染色程度，用1%三氯化铁水溶液浸泡30s-l min，至石细胞为淡黄色，用自来水充分洗去氯化铁溶液,再用蒸馏水浸泡I分钟。6.根据权利要求1所述的脱水，其特征在于:用90%乙醇急速分化I分钟，然后经95%乙醇I浸泡分钟、无水乙醇浸泡I分钟。7.根据权利要求1所述的二甲苯处理，其特征在于:1/2乙醇+1/2二甲苯浸泡3分钟—二甲苯浸泡5分钟一二甲苯浸泡5分钟一中性树胶封片,制作成永久切片。
【专利摘要】本发明一种库尔勒香梨细胞切片立体染色方法，其特征是将5%苏木精无水乙醇溶液、10%三氯化铁溶液、碘-碘化钾溶液和30%过氧化氢溶液按照一定的比例混合后对库尔勒香梨果实细胞切片进行染色，将细胞壁染成褐色，细胞核染成紫黑色，石细胞染成淡黄色至褐色，输导组织染成淡褐色，各部位细胞清楚可见、区分明显，实现了立体染色效果。解决了传统染色方法染色时间不易把握，石细胞和输导组织细胞模糊不清楚，果肉细胞边界不明显的缺陷。可应用于库尔勒香梨果实生长发育各时期细胞的研究。本发明试验方法操作简单，节约时间；节省材料，不用盖玻片就能观察；也可经二甲苯处理后制作成永久切片，用于科研教学领域。
【IPC分类】G01N1/30
【公开号】CN105571920
【申请号】CN201410537088
【发明人】李疆, 李鹏, 罗淑萍
【申请人】新疆农业大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年10月13日