一种测定栀子黄产品中藏花酸衍生物总量和组成的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种测定栀子黄产品中藏花酸衍生物 (主要包括酯)总量和组成的方法。
【背景技术】
[0002] 栀子，学名Gardenia jasminoides Ellis，又名:黄果子、山黄枝、黄栀子、山栀子、 水栀子、越桃、木丹、山黄栀、白蟾等，属茜草科植物。栀子的果实为传统中药材，是卫生部颁 布的药食两用资源。栀子果实是秦汉以前应用最广的黄色染料。其中主要的色素为藏花酸 衍生物，主要为一系列糖苷构成的酯类，含量最多的是藏花素(Crocin)。
[0003] 栀子黄是中国（GB-2760)和日本两国均已批准合法使用的食品添加剂，属着色剂。 其功能是给食品着色。
[0004] 栀子黄是栀子果实的萃取物。其中主要的色素是一系列藏花酸（亦称西红花酸， Crocetin)衍生物(主要为酯）。藏花酸为化合物的中文习惯命名，Crocetin为化合物的英文 习惯命名，8，8'_双阿朴胡萝卜素-8，8'_二酸为化合物的中文半系统命名，8,8'_ Diapocarotene-8,8'_dioic acid为化合物的英文半系统命名。化合物分子式为C2QH24O4,分 子量为328.402Da。由于藏花酸分子中存在7个共辄双键，在理论上它可存在多种几何异构 体。在自然界中，全反式异构体的数量最多，最常见。全反式藏花酸分子的结构如下：
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[0006] 栀子黄由色素和非色素组分组成。其中的色素组分包含一系列藏花酸衍生物和少 量非藏花酸衍生物组分，具有颜色。非色素组分不具颜色。在色素组分中，藏花酸衍生物占 多数。在藏花酸衍生物中，藏花素(Crocin)占多数。藏花素是由两个龙胆二糖和藏花酸形成 的酯化物。其熔点为186°C，结晶体为深橙色，在水溶液中显橘黄色。全反式藏花素分子的结 构为：
[0008]中国和日本两国均已颁布了栀子黄产品的国家标准。这两份文件都描述了应用电 子吸收光谱法(υν-vis)测定产品吸光系数（以色价表示）的方法，但未涉及藏花酸衍生物含 量的测定，只提出将藏花素作为产品的标志性成分来描述产品的着色功能。这种评价方法 具有简便易行的优点，但不能全面反映产品的着色功能与色素间的量效关系，也不利于产 品的安全性评估。
[0009] 到目前为止，栀子黄中尚有部分藏花酸衍生物和非藏花酸衍生物组分的分子结构 尚未被描述清楚。描述这些组分结构的努力仍在持续。在这种情况下，测定这些组分的浓度 吸光系数（如AID是可能的。已知这些未知组分的浓度吸光系数后，可以完成栀子黄样品 中藏花酸衍生物组分总量和组成的测定。
【发明内容】
[0010] 为了克服现有的标准中只对栀子黄色素着色功能定性描述的不足，实现对栀子黄 色素着色物质的定量检测，全面反映产品的着色功能与色素间的量效关系，便于对产品的 安全性进行评估，本发明提供一种测定栀子黄产品中藏花酸衍生物总量和组成的方法。所 述方法可在部分藏花酸衍生物分子结构尚未明确的情况下使用，并具有简单、易行、重复性 良好等优点。
[0011] 为实现上述目标，本发明采用以下技术方案：
[0012] 一种测定栀子黄产品中藏花酸衍生物总量和组成的方法，所述方法包括测定已知 浓度的栀子黄样品水溶液的吸光值，推算总藏花酸衍生物吸光系数，按郎伯比尔定律计算 样品中藏花酸衍生物总量;根据各藏花酸衍生物组分的色谱峰面积和吸光系数计算样品中 各藏花酸衍生物组分的相对质量，根据栀子黄样品的藏花酸衍生物总量和各藏花酸衍生物 组分的相对质量计算样品中各藏花酸衍生物组分的质量。
[0013] -种测定栀子黄产品中藏花酸衍生物总量和组成的方法，所述方法包括以下步 骤：
[0014] 1)测定栀子黄样品的吸光值。称取Μ克栀子黄样品，溶解并定容于V毫升水中，将溶 液稀释Ν倍，在紫外-可见光(UV-VIS)分光光度计上测定稀释液在440nm波长下的吸光值Α。 [0015] 2)获得样品的色谱图。在高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC)上获得样品的色谱图。色谱条件是：固定相为C18柱，参数为：250 X 4.6mm i .d.，5μηι。流动相A为水-乙腈-乙酸，体积比为74.95:25:0.05。流动相B为乙腈。采取 线性梯度洗脱方法:流动相B在20分钟内从0升至13.3% (V/V)，20-35分钟内B维持13.3% (V/V)，流速为0.8毫升/分，进样体积20微升，柱温为室温。检测波长为440nm。对各组分积分 得到峰面积。
[0016] 3)鉴定含有藏花酸结构的各组分。应用HPLC-MS-MS，鉴定色谱图上含有藏花酸结 构的各组分。色谱条件：同步骤2)。质谱条件:喷雾电压:-4Kv，鞘气30arb，辅助气lOarb，吹 扫气Oarb;毛细管温度350 °C ;负离子检测模式;数据依赖性扫描;CID碰撞能量35 % ;碎片质 量检测范围m/z为150至2000。
[0017] 4)记录各组分的分子离子峰m/z值。在一级质谱图上，鉴定各含藏花酸结构组分的 分子尚子峰，并记录各含藏花酸结构组分的分子尚子峰m/z值。
[0018] 5)计算各藏花酸衍生物组分的峰面积相对比例。按式（1)计算各藏花酸衍生物组 分峰面积的相对比例：
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[0020] 其中，是含藏花酸结构组分i峰面积的相对比例，Fi是组分i的峰面积，η是含藏 花酸结构组分的数量。
[0021] 6)计算各藏花酸衍生物组分的浓度吸光系数。根据已公布的藏花酸浓度吸光系数 Α^=3820 (甲醇），按式(2)计算各含藏花酸结构组分的浓度吸光系数：
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[0023] 其中，是含藏花酸结构组分i的浓度吸光系数，定义为1%(W/W)的样品溶液在 lcm光程的比色杯中在440nm波长下的吸光值；是已公布的藏花酸在440nm下的浓度 吸光系数，在此采用的值为45^=3820 (甲醇是含藏花酸结构组分的编号;MWC是藏花 酸分子量[Da] 是含藏花酸结构组分i的分子量[Da]，在此，采用该组分分子离子峰的m/ 乙值。
[0024] 7)计算栀子黄产品中总藏花酸衍生物的浓度吸光系数。根据式（1)和式(2)的计算 结果，按式(3)以加权求和法计算栀子黄中总藏花酸衍生物的浓度吸光系数：
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[0026] 其中，总藏花酸衍生物的浓度吸光系数，是含藏花酸结构组分i的 峰面积的相对比例，4=是含藏花酸结构组分i的浓度吸光系数，定义为i%(w/w)的样品溶 液在lcm光程的比色槽中在440nm下的吸光值，i是含藏花酸结构组分的编号，η是含藏花酸 结构组分的数量。
[0027] 8)计算总藏花酸衍生物在总色素中的相对含量。按式(4)计算总藏花酸衍生物在 总色素中的相对含量：
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[0029] 其中，M'Tcital是总藏花酸衍生物在总色素中的相对含量，Fi是含藏花酸结构组分i 的峰面积，η是含藏花酸结构组分的峰的数量，R是在440nm下有吸收组分j的峰面积，m是在 440nm下有吸收组分的数量。
[0030] 9)计算栀子黄样品中总藏花酸衍生物含量。根据式（1)、式(3)和式(4)所得结果， 按式(5)计算栀子黄样品中总藏花酸衍生物含量：
[0031]
[0032] 其中，MTotai是栀子黄样品中总藏花酸衍生物含量；A是样品溶液的吸光值； 是总藏花酸衍4物的浓度吸光系数