一种卷烟主流烟气中氨基酸的测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种卷烟主流烟气中氨基酸的测定方法，该方法包括：用剑桥滤片捕集卷烟主流烟气中的氨基酸；卷烟抽吸后，将收集完卷烟主流烟气样品的剑桥滤片取出，加入内标后，采用稀盐酸溶液进行超声萃取，过滤膜后进入高效液相色谱?串联质谱仪进行测定，内标法定量。本发明的特点是：采用同位素稀释内标法定量避免了分析过程中基质效应的影响；本发明采用直接进样，可快速、准确检测出卷烟主流烟气中17种氨基酸的含量，且重复性和回收率好，适用于工业中大批量样品的分析。
【专利说明】
一种卷烟主流烟气中氨基酸的测定方法
技术领域
[0001] 本发明属于理化检验技术领域，具体涉及卷烟主流烟气中氨基酸含量的测定方 法。
【背景技术】
[0002] 氨基酸是构成生物体蛋白质最基本的物质，是生物体内不可缺少的成分之一。它 不仅具有多种生理功能，还可作为呈味剂和营养源而广泛应用于食品添加剂中。氨基酸是 烟草中的一类重要化合物，在烟草调制、醇化、发酵加工、烘丝直至燃烧过程中，游离氨基酸 与还原糖(或羰基化合物)之间发生酶催化及非酶催化的褐色反应，生成多种具有烤香或爆 米花香味特征的吡喃、吡嗪、吡咯、吡啶类等杂环化合物，某些氨基酸如苯丙氨基酸还可自 身分解成香味化合物，如苯甲醇、苯乙醇等。
[0003] 卷烟烟气中的氨基酸是影响卷烟产品吸味的重要因素之一，烟叶中的氨基酸也可 能通过卷烟燃吸过程进入人体，满足机体新陈代谢的需要。但目前以卷烟烟气中氨基酸为 研究对象的检测方法鲜有报道。
[0004] 为提升卷烟抽吸品质，建立一种适合于卷烟主流烟气中氨基酸测定的、分析速度 快、重复性和回收率好且适用于大批量样品的分析的氨基酸的测定方法意义重大。
【发明内容】
[0005] 本发明弥补了现有分析技术的不足，提供了一种特别适合于卷烟主流烟气中氨基 酸含量的测定方法。
[0006] 本发明公开了一种卷烟主流烟气中氨基酸的测定方法，该方法包括：用剑桥滤片 捕集卷烟主流烟气中的氨基酸;卷烟抽吸后，将收集完卷烟主流烟气样品的剑桥滤片取出， 加入内标后，采用稀盐酸溶液进行超声萃取，过滤膜后进入高效液相色谱-串联质谱仪进行 测定，内标法定量。
[0007] 本发明提供的一种卷烟主流烟气中氨基酸含量的测定方法优选技术方案为：
[0008] ①萃取液的制备：用浓盐酸配制0.01-0.5mol/L的稀HC1溶液，作为萃取液；
[0009]②配制内标溶液:称取一定量亮氨酸_d3，用萃取液配制浓度为0.01-0.5wnol/mL 的内标溶液；
[0010] ③配制混合标准溶液：用萃取液为溶剂，将17种氨基酸混标配成不同系列浓度的 标准溶液，脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、组氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、 苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸的浓度为〇 . 〇 1 . 1 Mo 1/mL，胱 氨酸的浓度为0 ? 01-0 ? lwnol/mL;
[0011] ④卷烟的抽吸:将平衡好的待测卷烟样品用吸烟机按照GB/T19609规定的标准条 件进行抽吸，抽吸10-30支卷烟，用剑桥滤片捕集卷烟主流烟气中的17种氨基酸；
[0012] ⑤样品前处理及分析:卷烟抽吸后，取下剑桥滤片并放入三角瓶中，依次加入内标 溶液和萃取液，超声萃取，取上层清液经水相滤膜过滤后，供LC-MS/MS测定；
[0013] ⑥标准曲线的绘制：取混合标准溶液〇 . 〇2ml、0.05ml、0 . lmL、0.25mL、0.5mL、 1. OmL、5. OmL，各加入内标溶液1 OOyL，用萃取液定容至50mL，摇匀，得6级工作标准溶液;对 上述系列标准溶液进行LC-MS/MS分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比 值进行线性回归分析，求得17种氨基酸的标准曲线；
[0014] ⑦数据处理与检测：由组分峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量。
[0015] 本发明提供的一种卷烟主流烟气中氨基酸含量的测定方法更优选的技术方案为： [0016]①萃取液的制备：用浓盐酸配制0.05mol/L的稀HC1溶液，作为萃取液；
[0017] ②配制内标溶液:称取一定量亮氨酸-d3，用萃取液配制浓度为0. lwnol/mL的内标 溶液；
[0018] ③配制混合标准溶液：用萃取液为溶剂，将17种氨基酸混标配成不同系列浓度的 标准溶液，脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、组氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、 苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸的浓度为〇.〇25ymol/mL，胱氨酸 的浓度为 〇.〇125wnol/mL;
[0019]④卷烟的抽吸:将平衡好的待测卷烟样品用吸烟机按照GB/T19609规定的标准条 件进行抽吸，抽吸20支卷烟，用剑桥滤片捕集卷烟主流烟气中的17种氨基酸；
[0020] ⑤样品前处理及分析:卷烟抽吸后，取下剑桥滤片并放入三角瓶中，依次加入内标 溶液和萃取液，超声萃取，取上层清液经水相滤膜过滤后，供LC-MS/MS测定；
[0021] ⑥标准曲线的绘制：取混合标准溶液0.02ml、0.05ml、0 . lmL、0.25mL、0.5mL、 1. OmL、5. OmL，各加入内标溶液100yL，用萃取液定容至50mL，摇匀，得6级工作标准溶液;对 上述系列标准溶液进行LC-MS/MS分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比 值进行线性回归分析，求得17种氨基酸的标准曲线；
[0022] ⑦数据处理与检测：由组分峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量。
[0023]进一步地，在步骤⑤中，内标溶液和萃取液的加入量分别为50-150yL和30-100mL; 优选内标溶液和萃取液的加入量分别为1 〇〇yL和50mL。
[0024] 进一步地，在步骤⑤中，超声萃取的时间为20-60min，功率为200-500W;优选超声 萃取的时间为30min，功率为300W。
[0025] 进一步地，在步骤⑤中，水相滤膜为0.22-1.2wii醋酸纤维素滤膜;优选水相滤膜为 0.22mi醋酸纤维素滤膜。
[0026] 进一步地，在步骤⑤和⑥中，高效液相色谱条件为：
[0027] 色谱柱:Agilent Z0RBAX Eclipse AAA色谱柱，柱参数为150mmX4.6mmX5iim;
[0028] 进样量 5yL;
[0029] 柱温为 3(TC;
[0030] 流速为0.4mL/min，梯度洗脱程序为：
[0032]进一步地，在步骤⑤和⑥中，质谱条件为：质谱检测采用ESI离子源，在正离子扫描 方式下，选择MRM工作模式进行二级质谱分析，优化后的主要质谱条件为：电喷雾电压 5000V;雾化气50psi，辅助加热气50psi，气帘气lOpsi，干燥温度600°C;各化合物的特征离 子及参数分别为：
[0035] 本发明相对于现有技术，取得了显著的进步：
[0036] 本发明使用的仪器和设备均为实验室常规分析设备，这使得本发明提供的检测方 法检测成本低，更易于推广；
[0037] 本发明采用同位素稀释内标法定量避免了复杂混合物体系定量分离、纯化的困 难，更好的克服了基质效应的影响，检测结果准确度高；
[0038] 本发明填补了采用高效液相色谱-串联质谱联用仪测定卷烟主流烟气中氨基酸的 检测方法的空白，率先建立了采用高效液相色谱-串联质谱联用仪测定卷烟主流烟气中17 种氨基酸的分析方法;本发明提供的检测方法分析速度快，重复性和回收率好，特别适用于 工业中大批量样品的检测分析。
【附图说明】
[0039] 图1是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸的提取离子流图；
[0040] 图2是缬氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的提取离子流图；
[0041 ]图3是内标、赖氨酸、谷氨酸、蛋氨酸的提取离子流图。
[0042] 图4是组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、胱氨酸的提取离子流图。
【具体实施方式】
[0043] 为便于更好的理解本发明，本发明结合具体的实施例进一步说明：
[0044] 实施例1
[0045] 仪器与试剂、材料：美国AB SCIEX 5500LC-MS/MS;美国Agilent 1290HPLC; Agilent ZORBAX Eclipse AAA色谱柱（150mmX4.6mm,粒径5_)，0.22讓微孔过滤膜，超声 清洗器;超纯水(18MQ )，乙腈(色谱纯，百灵威化学试剂公司），17种氨基酸混标。
[0046]萃取液的制备：用浓盐酸配制0.05mol/L的稀HC1溶液，作为萃取液；
[0047] 配制内标溶液:称取一定量亮氨酸-d3，用萃取液配制浓度为0. lwnol/mL的内标溶 液；
[0048] 配制混合标准溶液：用萃取液为溶剂，将17种氨基酸混标配成不同系列浓度的标 准溶液，脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、组氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏 氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸的浓度为〇. 〇25ymo 1/mL，胱氨酸的 浓度为 〇 ? 〇125ymol/mL;
[0049] 卷烟的抽吸:将平衡好的待测卷烟样品用吸烟机按照GB/T19609规定的标准条件 进行抽吸，抽吸20支卷烟，用剑桥滤片捕集卷烟主流烟气中的17种氨基酸；
[0050] 样品前处理:卷烟抽吸后，取下剑桥滤片并放入三角瓶中，依次加入100此内标溶 液和50mL萃取液，超声(功率为300W)萃取30min，取上层清液经0.22mi醋酸纤维素滤膜过滤 后，供LC-MS/MS测定；
[0051] 高效液相色谱条件：
[0052] 色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse AAA色谱柱，柱参数为150mmX4.6mmX5iim;
[0053] 进样量 5yL;
[0054]柱温为 30 °C;
[0055] 流速为0.4mL/min，梯度洗脱程序如表1所示：
[0056]表1高效液相色谱梯度洗脱条件
[0058]质谱条件:质谱检测采用ESI离子源，在正离子扫描方式下，选择MRM工作模式进行 二级质谱分析，优化后的主要质谱条件为：电喷雾电压5000V;雾化气50psi，辅助加热气 50psi，气帘气20psi，干燥温度600°C;各化合物的特征离子及参数如表2所示：
[0059]表2 17种氨基酸及内标的特征离子及参数
[0062] 标准曲线的绘制：取混合标准溶液0 ? 02ml、0 ? 05ml、0 ? lmL、0 ? 25mL、0 ? 5mL、1 ? OmL、 5. OmL，各加入内标溶液100yL，用萃取液定容至50mL，摇匀，得6级工作标准溶液;对上述系 列标准溶液进行LC-MS/MS分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行 线性回归分析，求得17种氨基酸的标准曲线；17种氨基酸的线性回归方程、相关系数、检出 限和定量限如表3所示。
[0063] 表3 17种氨基酸的线性回归方程、相关系数、检出限和定量限
[0066]精密度:为了考察方法的精密度，以某卷烟样品进行5次日内重复实验，测定结果 表明17种氨基酸日内测定结果的相对标准偏差在0.93%~7.29%之间，表明方法的日内精 密度良好。同时，对样品进行了5天日间重复实验，测定结果表明17种氨基酸日间测定结果 的相对标准偏差在2.33 %~9.64 %之间，结果表明该方法的日间重复性良好。
[0067] 回收率:采用样品加标法对某卷烟样品在高、中、低三个含量水平上进行了回收率 的测定，结果表明，17种氨基酸的平均回收率的结果在89.1 %-103.8%之间，回收率较高， 满足分析要求。
[0068] 实际样品的测定:采用本发明建立的方法测定了 6个卷烟样品主流烟气中的氨基 酸(表3 )，卷烟主流烟气中氨基酸的含量范围为1.2-1539.7ng/支。
[0069] 表3卷烟样品主流烟气中氨基酸的检测结果(ns?/支）
[0072]从上述实验数据可以看出，本发明采用同位素稀释内标法定量避免了复杂混合物 体系定量分离、纯化的困难，更好的克服了基质效应的影响，检测结果精密度高、重复性好、 回收率高，且分析速度快，特别适用于工业中大批量样品的检测分析。本发明提供的方法对 于提升卷烟抽吸品质具有重要意义。
【主权项】
1. 一种卷烟主流烟气中氨基酸的测定方法，其特征在于:该方法包括W下步骤： 用剑桥滤片捕集卷烟主流烟气中的氨基酸;卷烟抽吸后，将收集完卷烟主流烟气样品 的剑桥滤片取出，加入内标后，采用稀盐酸溶液进行超声萃取，过滤膜后进入高效液相色 谱-串联质谱仪进行测定，内标法定量。2. 根据权利要求1所述的一种卷烟主流烟气中氨基酸的测定方法，其特征在于，该方法 包括W下步骤： ① 萃取液的制备：用浓盐酸配制O. Ol-0.5mol/L的稀肥1溶液，作为萃取液； ② 配制内标溶液:称取一定量亮氨酸-Cb，用萃取液配制浓度为0.0 l-O. SwnoVmL的内标 溶液； ③ 配制混合标准溶液：用萃取液为溶剂，将17种氨基酸混标配成不同系列浓度的标准 溶液，脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、组氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨 酸、酪氨酸、鄉氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸的浓度为0.01-0.1皿ol/mL，脫氨酸 的浓度为0.0 l-0.1皿ol/ni; ④ 卷烟的抽吸:将平衡好的待测卷烟样品用吸烟机按照GB/T19609规定的标准条件进 行抽吸，抽吸10-30支卷烟，用剑桥滤片捕集卷烟主流烟气中的17种氨基酸； ⑤ 样品前处理及分析:卷烟抽吸后，取下剑桥滤片并放入=角瓶中，依次加入内标溶液 和萃取液，超声萃取，取上层清液经水相滤膜过滤后，供LC-MS/MS测定； ⑥ 标准曲线的绘制：取混合标准溶液0.02ml、0.05ml、0 . lmL、0.25mL、0.5mL、1. OmL、 5. OmL，各加入内标溶液，用萃取液定容，摇匀，得6级工作标准溶液;对上述系列标准溶液进 行LC-MS/MS分析，W目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线性回归分 析，求得17种氨基酸的标准曲线； ⑦ 数据处理与检测：由组分峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量。3. 根据权利要求1所述的一种卷烟主流烟气中氨基酸的测定方法，其特征在于，该方法 包括W下步骤： ① 萃取液的制备：用浓盐酸配制0. 〇5mol/L的稀肥1溶液，作为萃取液； ② 配制内标溶液:称取一定量亮氨酸-Cb，用萃取液配制浓度为0.1 wnol/mL的内标溶液； ③ 配制混合标准溶液：用萃取液为溶剂，将17种氨基酸混标配成不同系列浓度的标准 溶液，脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、组氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨 酸、酪氨酸、鄉氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸的浓度为0.025WHO1 /mL，脫氨酸的浓 度为 0.0125 皿 ol/ni; ④ 卷烟的抽吸:将平衡好的待测卷烟样品用吸烟机按照GB/T19609规定的标准条件进 行抽吸，抽吸20支卷烟，用剑桥滤片捕集卷烟主流烟气中的17种氨基酸； ⑤ 样品前处理及分析:卷烟抽吸后，取下剑桥滤片并放入=角瓶中，依次加入内标溶液 和萃取液，超声萃取，取上层清液经水相滤膜过滤后，供LC-MS/MS测定； ⑥ 标准曲线的绘制：取混合标准溶液0.02ml、0.05ml、0 . lmL、0.25mL、0.5mL、1. OmL、 5. OmL，各加入内标溶液10化L，用萃取液定容至50mL，摇匀，得6级工作标准溶液;对上述系 列标准溶液进行LC-MS/MS分析，W目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行 线性回归分析，求得17种氨基酸的标准曲线； ⑦ 数据处理与检测：由组分峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量。4. 根据权利要求3所述的卷烟主流烟气中氨基酸的测定方法，其特征在于：在步骤⑤ 中，内标溶液加入量为50-150化，萃取液加入量为30-1 OOmL。5. 根据权利要求4所述的卷烟主流烟气中氨基酸的测定方法，其特征在于：在步骤⑤ 中，内标溶液加入量为10化U萃取液加入量为50mL。6. 根据权利要求3所述的卷烟主流烟气中氨基酸的测定方法，其特征在于：在步骤⑤ 中，超声萃取的时间为20-60min，功率为200-500W。7. 根据权利要求6所述的卷烟主流烟气中氨基酸的测定方法，其特征在于：在步骤⑤ 中，超声萃取的时间为30min，功率为300W。8. 根据权利要求3所述的卷烟主流烟气中氨基酸的测定方法，其特征在于：在步骤⑤ 中，水相滤膜为0.22-1.2曲!醋酸纤维素滤膜。9. 根据权利要求8所述的卷烟主流烟气中氨基酸的测定方法，其特征在于：在步骤⑤ 中，水相滤膜为0.22曲!醋酸纤维素滤膜。10. 根据权利要求1-9中任一所述的卷烟主流烟气中氨基酸的测定方法，其特征在于： 在步骤⑤和⑥中，高效液相色谱条件为： 色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse AAA色谱柱，柱参数为 150mmX4.6mmX5皿； 进样量扣レ 柱溫为30°C; 流速为0.4mL/min，梯度洗脱程序为：11. 根据权利要求10所述的卷烟主流烟气中氨基酸的测定方法，其特征在于:在步骤⑤ 和⑥中，质谱条件为:质谱检测采用ESI离子源，在正离子扫描方式下，选择MRM工作模式进 行二级质谱分析，优化后的主要质谱条件为：电喷雾电压5000V;雾化气50psi，辅助加热气 50psi，气帘气1 Opsi，干燥溫度600°C ;各化合物的特征离子及参数分别为：12.根据权利要求11所述的卷烟主流烟气中氨基酸的测定方法，其特征在于： ① 萃取液的制备：用浓盐酸配制O. 〇5mol/L的稀肥1溶液，作为萃取液； ② 配制内标溶液:称取一定量亮氨酸-Cb，用萃取液配制浓度为O. Iwnol/mL的内标溶液； ③ 配制混合标准溶液：用萃取液为溶剂，将17种氨基酸混标配成不同系列浓度的标准 溶液，脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、组氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨 酸、酪氨酸、鄉氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸的浓度为0.025WHO1 /mL，脫氨酸的浓 度为 0.0125 皿 ol/ni; ④ 卷烟的抽吸:将平衡好的待测卷烟样品用吸烟机按照GB/T19609规定的标准条件进 行抽吸，抽吸20支卷烟，用剑桥滤片捕集卷烟主流烟气中的17种氨基酸； ⑤ 样品前处理及分析:卷烟抽吸后，取下剑桥滤片并放入=角瓶中，依次加入内标溶液 和萃取液，超声萃取，取上层清液经水相滤膜过滤后，供LC-MS/MS测定； ⑥ 标准曲线的绘制：取混合标准溶液0.02ml、0.05ml、0 . lmL、0.25mL、0.5mL、1. OmL、 5. OmL，各加入内标溶液10化L，用萃取液定容至50mL，摇匀，得6级工作标准溶液;对上述系 列标准溶液进行LC-MS/MS分析，W目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行 线性回归分析，求得17种氨基酸的标准曲线； ⑦数据处理与检测：由组分峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量； 在步骤⑤中，内标溶液加入量为10化L，萃取液加入量为50mL; 在步骤⑤中，超声萃取的时间为30min，功率为300W; 在步骤⑤中，水相滤膜为0.22WI1醋酸纤维素滤膜； 在步骤⑤和⑥中，高效液相色谱条件为： 色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse AAA色谱柱，柱参数为 150mmX4.6mmX5皿； 进样量扣レ 柱溫为30°C; 流速为0.4mL/min，梯度洗脱程序为：质谱条件为:质谱检测采用ESI离子源，在正离子扫描方式下，选择MRM工作模式进行二 级质谱分析，优化后的主要质谱条件为：电喷雾电压5000V;雾化气50psi，辅助加热气 50psi，气帘气1 Opsi，干燥溫度600°C ;各化合物的特征离子及参数分别为：
【文档编号】G01N30/88GK105911206SQ201610419938
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】李小兰, 范忠, 刘鸿, 陈 峰, 黄善松, 周芸, 许蔼飞, 吴晶晶, 孟冬玲, 王维刚, 蒋光辉
【申请人】广西中烟工业有限责任公司