检测癌细胞表面多糖表达的光致电化学纸芯片的制备
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测癌细胞表面多糖表达的纸基光致电化学纸芯片的制备方法。利用Adobe illustrator CS4软件设计纸芯片的疏水蜡打印图案；利用蜡打印机打印纸芯片；通过丝网印刷技术印刷工作电极、参比电极和对电极；在工作区生长金纳米粒子，进而连接光电材料氧化锌、碲化镉量子点、接金介孔硅，修饰HRP?mdsDNA为光致电化学体系提供内置光源和识别细胞的结合位点。最后加入多糖抑制剂，利用光电流响应的变化检测肿瘤细胞表面多糖的表达。
【专利说明】
检测癌细胞表面多糖表达的光致电化学纸芯片的制备
技术领域
[0001 ]本发明涉及纳米材料技术、杂交链反应，纸芯片技术、肿瘤细胞表面多糖表达检测技术领域，更具体地说是一种适合于原位检测肿瘤细胞表面多糖表达的纸基分析器件的构建。
【背景技术】
[0002]糖基化是一种对蛋白具有重要意义的修饰作用，可以调控蛋白质的功能。多糖是细胞表面的重要结构，和细胞的转移、分化密切相关。细胞表面多糖的表达是一种和细胞环境和状态紧密联系的动态过程。多糖的非正常表达不仅和很多病理学现象相关并且是很多疾病的标志物。因此检测细胞表面多糖的表达对临床诊断和治疗具有非常重要的意义。目前用于多糖表达分析的方法(质谱、核磁共振、高效液相色谱等)存在着操作复杂，仪器昂贵，生物破坏性大等弊端，因此我们急需发明一种低成本，易操作，灵敏度高，生物相容性好的检测方法。
[0003]近年来为了满足人们对简单，便携，高效，临床诊断设备的需求，纸芯片开始被用作生物分析实验平台。由于表面的粗糙和内部的孔洞使纸具有很大的比表面积，并且纸还具有低成本，易弯曲、折叠、操作等优点。光致电化学作为新兴的一种生物检测方法具有较高的灵敏度和较低的背景信号。用于检测细胞表面多糖表达的纸基光致电化学方法解决了目前方法所面临的问题。
[0004]为了简化检测装置我们将化学发光作为内置光源代替传统光致电化学体系中的物理光源。为了提高检测灵敏度，我们将表面等离子体共振，多枝链杂交，石墨烯量子点引发的信号放大技术巧妙的结合到该体系中。表面等离子共振的引入使被量子点敏华的光电材料氧化锌具有更好的光电性能。多枝链杂交技术的引入可以提供大量辣根过氧化酶，从而很好的催化了鲁米诺化学发光，为该体系提供了内置光源，同时H1、H2的一端是细胞识别链的设计也为捕获肿瘤细胞提供了更多的结合位点。石墨烯量子作为一种新型碳基材料，由于其低毒性，易溶解，优良的生物相容性等特点越来越受到人们的关注，并且它还具有优良的光电性能。通过伴刀豆球蛋白A和细胞表面多糖的特异性识别而引入的石墨烯量子点可以竞争性吸收化学发光和电子供体，因此导致光电流信号的变化，从而可以检测细胞表面多糖的表达。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是基于化学发光作为内置光源，结合表面等离子体共振，杂交链反应和石墨烯量子点引发的信号放大策略构建的用于实现原位检测肿瘤细胞表面多糖表达的光致电化学纸基设备。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的:
(I)在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计纸芯片的打印图案，如附图1所示； (2)将步骤(I)中设计的打印图案通过蜡打印机打印在色谱纸上，随后将带有蜡图案的A4色谱纸放置到平板加热器或烘箱中，在130 °C下加热2 min，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；
(3)将步骤(2)中得到的蜡打印色谱纸通过丝网印刷技术印刷碳工作电极、Ag/AgCl参比电极和碳对电极，如附图2所示；
(4)在步骤(3)中得到的色谱纸的样品板工作区长金纳米粒子后，依次连接光电材料氧化锌、碲化镉量子点和接金介孔硅；
(5 )在步骤(4 )中处理过的工作区上修饰含有识别链和辣根过氧化酶的多枝双链DNA(HRP-mdsDNA)，随后用牛血清白蛋白封锁活性位点；
(6)将含有肿瘤细胞的试样在固定HRP-mdsDNA的工作区域孵育；
(7)将石墨烯量子点功能化的伴刀豆球蛋白A滴到捕获细胞后的工作区域继续孵育，如附图3所示；
(8)将步骤(7)处理后的纸芯片折叠，将含有过氧化氢和鲁米诺的缓冲液滴加到印有参比电极对电极的纸层上，连接电化学工作站进行细胞表面多糖的测定；
(9 )在步骤(6 )捕获细胞后的工作区域滴加多糖抑制剂；
(10)重复步骤(7)和步骤(8)，对细胞表面多糖的表达进行测定。
[0007]本发明所述的纸芯片的尺寸如附图1所示，纸纸芯片由边长分别为20mm的正方形辅助板和样品板组成，辅助区域和工作区域分别为直径为8 mm和6 mm的圆形区域，辅助板与样品板之间是宽度为Imm的线折叠区。
[0008]本发明所描述的疏水区域形成的具体步骤为:
利用蜡打印技术在A4大小的一号色谱纸上打印蜡疏水图案，将打印蜡的色谱纸在130°C下烘烤2 min，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水区，没有打印蜡的部分为亲水区即为工作区。
[0009]本发明在步骤(3)中所述打印电极的具体步骤为:
采用丝网印刷技术、石墨为原料，取等体积的丙酮和环己酮溶液，再加入对应量的乙酸纤维素，使用超声波超声使乙酸纤维素充分的溶解在丙酮和环己酮的混合溶剂中，最后加入一定量的石墨粉，用玻璃棒充分混匀，在纸上印制工作电极，碳对电极和Ag/AgCl参比电极。
[0010 ]本发明在步骤(4 )中所述接金的介孔娃的制备步骤为:
将0.2 g十六烷基三甲基溴化铵溶于100 mL 二次水中后，加入700 yL 2.0 M氢氧化钠并在80 °C下加热20 min，然后将1.0 mL正硅酸四乙酯加入到上述溶液后继续搅拌2 h，然后将获得的产物离心，洗涤并干燥，随后称取0.164 g上述产物溶于含1.5 mL 37% HCl的75 mL乙醇中回流10 h，将所得产物离心，洗涤并在60 °C下干燥4 h，获得介孔硅，取10 mg合成的介孔硅溶于10 mL质量浓度为0.5 %的聚乙烯吡咯烷酮溶液中并在室温下搅拌2 h，然后将离心后的沉淀溶到2 mL质量浓度为1.0%的氯金酸溶液中，搅拌6 h后接着用0.2 M的葡萄糖在95 °C条件下将三价金还原，最后得到接金的介孔硅。
[0011 ] 本发明在步骤(5)中所描述的HRP-mdsDNA制备步骤为:
将1、Hl和H2通过PTC-200在95 °C下加热10 min，然后在30 s内冷却到4 °C，随后将100 yL I加到I mL 1:1的Hl、H2中，在37弋环境下反应过夜，最后将10 yg/mL链酶亲和素化的辣根过氧化酶和上述溶液反应15 min，离心，将得到的产物分散在2 mL磷酸缓冲溶液中。
[0012]本发明在步骤(7)中所描述的石墨烯量子点功能化的伴刀豆球蛋白A的制备步骤为:
将0.25 g炭黑溶于50 mL 6 M硝酸中，超声I h后在130 °C条件下回流24 h，将上述溶液降到室温后离心并干燥，然后将产物溶于二次水后透析三天，得到石墨烯量子点，将800yL合成的石墨烯量子点和100 yL 2 mM的伴刀豆球蛋白A混合到10.0 mL水溶液中并在4 °C下反应过夜。
[0013]本发明所述多糖抑制剂为衣霉素。
[0014]本发明的有益效果
(I)化学发光作为内置光源使得操作更加简单。
[0015](2)接金介孔硅的引入产生了表面等离子体效应，大大提高了光电材料的光电性會K。
[0016](3)多枝杂交链的引入可以为体系提供做足够多的酶和细胞捕获结合位点，大大提尚了检测的灵敏性。
[0017](4)本发明构建的纸基光致电传感器成本低廉，操作简单，检测灵敏度高，可以实现对肿瘤细胞表面多糖表达的检测。
【附图说明】
[0018]附图1:纸芯片的疏水蜡打印图案；
附图2:纸芯片的丝网印刷电极图案；
附图3:细胞传感器的构建过程。
【具体实施方式】
[0019]为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图进一步阐明本发明的内容。
[0020]实施例1
纸基光致电化学设备在检测MCF-7细胞表面多糖表达的应用:
(1)在计算机上利用Adobeillustrator CS4软件设计纸芯片的打印图案；
(2)将步骤(I)中设计的打印图案通过蜡打印机打印在一号色谱纸上，随后将带有蜡图案的A4色谱纸放置到平板加热器或烘箱中，在130 °C下加热2 min，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；
(3)将步骤(2)中得到的蜡打印色谱纸通过丝网印刷技术印刷碳工作电极、Ag/AgCl参比电极和碳对电极；
(4)在步骤(3)中得到的色谱纸的样品板工作区长金后，依次连接光电材料氧化锌、碲化镉量子点和接金的介孔硅；
量取160 mL二次水于单口烧瓶中，加热至96 °(:后加入1.6 mL 1%氯金酸，反应I min后加入5.6 mL 1%的柠檬酸钠，并继续搅拌15 min至溶液变为酒红色，合成金纳米种子，取50此金纳米种子滴加在工作区室温下静置I h，用二次水洗去多余的金纳米种子，重复五次，将新鲜制备的80 yL含有20 mM氯金酸，200 mM盐酸羟胺的混合液加入到工作区，在室温下生长30 min后用二次水清洗工作区获得长金的纸电极；
称取2.5 g可溶性淀粉溶于75 mL沸水中，在85 °C下搅拌5 min后加入5 mmol六水合硝酸锌，通过逐滴加入氢氧化钠将溶液PH调至8-9后继续加热30 min，然后将获得的沉淀离心、洗涤并在500 °C下焙烧2 h获得多孔氧化锌，称取0.6 g获得的多孔氧化锌溶于0.1 mM的对巯基苯胺溶液中搅拌4 h，取50 yL功能化的氧化锌滴到长金的纸电极上，反应30 min后用二次水洗涤；
将3.6 mmol的巯基乙胺和100 mL 12 mM的氯化镉溶液混合搅拌，并通过逐滴加入1.0 M氢氧化钠调节溶液pH至5.7，然后将0.1 g硼氢化钠和0.06 mmol亚碲酸钠依次加入上述溶液并通入高纯氮气30 min，然后将混合溶液在100 °C下反应I h，获得带有氨基的碲化镉量子点，取25 yL合成的碲化镉量子点滴在2.5%的戊二醛处理后的连接氧化锌的电极上，反应35 min后用二次水冲洗；
将0.20 g十六烷基三甲基溴化铵溶于100 mL二次水中后，加入700 yL 2.0 M氢氧化钠并在80 °C下加热20 min，然后将1.0 mL正硅酸四乙酯加入到上述溶液后继续搅拌2 h，然后将获得的产物离心、洗涤并干燥，随后将0.164 g沉淀溶于含1.5 mL质量浓度为37 %盐酸的75 mL乙醇中回流10 h，将产物离心、洗涤并在60 °C下干燥4 h，称取10 mg合成的介孔硅溶于10 mL质量浓度为0.5 %的聚乙烯吡咯烷酮溶液中并在室温下搅拌2 h，将离心后的沉淀溶到2 mL质量浓度为1.0%的氯金酸溶液中，搅拌6 11后用0.2 M的葡萄糖在95 °C条件下将三价金还原，最后得到接金的介孔硅，取2.0 mL的上述溶液和4.0 mL的乙二胺混合稀释至10 mL超声I h后搅拌5 h获得氨基化的接金介孔娃，量取25 yL氨基化的接金介孔硅滴于2.5%的戊二醛处理后的连接碲化镉量子点的电极上反应35 min，并用二次水冲洗；
(5)在步骤(4)中处理过的工作区上修饰HRP-mdsDNA，随后用牛血清白蛋白封锁活性位点；
将1、Hl和H2通过PTC-200在95 °C下加热10 min，然后在30 s内冷却到4 °C，随后将100 yL I加到I mLl:1的H1、H2中，在37弋环境下反应过夜，最后将10 yg/mL的链酶亲和素化的辣根过氧化酶和上述溶液反应15 min，离心，将得到的产物分散在2 mL磷酸缓冲溶液中，取50 yL HRP-mdsDNA滴在修饰接金介孔硅的电极上孵化I h，然后用10 yL 2%牛血清蛋白封锁非特异性结合位点；
(6)将20yL含有MCF-7肿瘤细胞的试样在固定HRP-mdsDNA的工作区域孵育40 min；
(7)将石墨烯量子点功能化的刀豆球蛋白A滴到捕获细胞后的工作区继续孵育；
将0.25 g炭黑溶于50 mL 6 M硝酸中，超声I h后在130 °C条件下回流24 h，将上述溶液降到室温后离心并干燥，然后将产物溶于二次水后透析三天，得到石墨烯量子点，将800yL合成的石墨烯量子点和100 yL 2 mM的伴刀豆球蛋白A混合到10.0 mL水溶液中并在4 °C下反应过夜，然后取80 yL修饰石墨烯量子点的伴刀豆球蛋白A溶液滴于连有细胞的电极上孵化60 min；
(8)将步骤(7)处理后的纸芯片折叠，将含有过氧化氢和鲁米诺的缓冲液滴加到印有参比电极对电极的纸层上，连接电化学工作站进行细胞表面多糖的测定；
(9 )在步骤(6 )捕获细胞后的工作区域滴加多糖抑制剂衣霉素；
(1 )重复步骤(7 )和步骤(8 )，通过光电流响应的变化来实现对细胞表面多糖的表达。
【主权项】
1.检测癌细胞表面多糖表达的光致电化学纸芯片的制备，其特征包括以下步骤: 1.1在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计纸芯片的打印图案； 1.2将步骤1.1中设计的打印图案通过蜡打印机打印在色谱纸上，随后将打印过的A4色谱纸放置到平板加热器或烘箱中，在130 °C下加热2 min，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙； 1.3将步骤1.2中得到的蜡打印色谱纸通过丝网印刷技术印刷碳工作电极、Ag/AgCl参比电极和碳对电极； 1.4在步骤1.3中得到的色谱纸的样品板工作区长金后，依次连接光电材料氧化锌、碲化镉量子点和接金介孔硅； 1.5在步骤1.4中处理过的工作区上修饰含有识别链和辣根过氧化酶的多枝双链DNA(HRP-mdsDNA)，随后用牛血清白蛋白封锁活性位点； 1.6将含有肿瘤细胞的试样在固定HRP-mdsDNA的工作区孵育； 1.7将石墨烯量子点功能化的刀豆球蛋白A滴到捕获细胞后的工作区继续孵育； 1.8将步骤1.7处理后的纸芯片折叠，将含有过氧化氢和鲁米诺的缓冲液滴加到印有参比电极对电极的纸层上，连接电化学工作站进行细胞表面多糖表达的测定； 1.9在步骤1.6捕获细胞后的工作区域滴加多糖抑制剂衣霉素； 1.10重复步骤1.7和步骤1.8，实现对细胞表面多糖表达的检测。2.根据权利要求书I所述一种检测肿瘤细胞表面多糖表达的光致电化学纸芯片的制备，其特征是，通过Adobe illustrator CS4软件在计算机上设计光电致化学纸芯片的打印图案，纸芯片由边长分别为20 mm的正方形辅助板和样品板组成，辅助区域和工作区域分别为直径为8 mm和6 mm的圆形区域，辅助板与样品板之间是宽度为Imm的折叠区。3.根据权利要求书I所述一种检测肿瘤细胞表面多糖表达的光致电化学纸芯片的制备，其特征是，利用蜡打印技术在A4大小的一号色谱纸上打印蜡疏水图案，将打印蜡的色谱纸在130 °C下烘烤2 min，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水区，没有打印蜡的部分为亲水区即为工作区。4.根据权利要求书I所述一种检测肿瘤细胞表面多糖表达的光致电化学纸芯片的制备，其特征是，采用丝网印刷技术、石墨为原料，取等体积的丙酮和环己酮溶液，再加入对应量的乙酸纤维素，使用超声波超声使乙酸纤维素充分的溶解在丙酮和环己酮的混合溶剂中，最后加入一定量的石墨粉，用玻璃棒充分混匀，在纸上印制碳工作电极，Ag/AgCl和参比电极碳对电极。5.根据权利要求书I所述一种检测肿瘤细胞表面多糖表达的光致电化学纸芯片的制备，其特征是，在步骤1.4中所述接金介孔娃的制备步骤为: 将0.2 g十六烷基三甲基溴化铵溶于100 mL 二次水中后，加入700 yL 2.0 M氢氧化钠并在80 °C下加热20 min，然后将1.0 mL正硅酸四乙酯加入到上述溶液后继续搅拌2 h，然后将获得的产物离心，洗涤并干燥，后称取0.164 g上述产物溶于含1.5 mL质量分数为37% HCl的75 mL乙醇中回流10 h，将所得产物离心，洗涤并在60 °C下干燥4 h，获得介孔硅，取10 mg合成的介孔硅溶于10 mL质量分数为0.5 %的聚乙烯吡咯烷酮溶液中并在室温下搅拌2 h，然后将离心后的沉淀溶到2 mL质量分数为1.0%的氯金酸溶液中搅拌6 h，接着用0.2 M的葡萄糖在95 °C条件下将三价金还原，最后得到接金介孔硅。6.根据权利要求书I所述一种检测肿瘤细胞表面多糖表达的光致电化学纸芯片的制备，其特征是，步骤1.5中所述HRP-mdsDNA的制备步骤为: 将1、Hl和H2通过PTC-200在95 °C下加热10 min，然后在30 s内冷却到4 °C，随后将100 yL I加到I mL H1、H2(1:1)中，在37弋环境下反应过夜，最后将10 yg/mL链酶亲和素化的辣根过氧化酶和上述溶液反应15 min，离心，将得到的产物分散在2 mL磷酸缓冲溶液中。7.根据权利要求书I所述一种检测肿瘤细胞表面多糖表达的光致电化学纸芯片的制备，其特征是，步骤1.7中所述石墨烯量子点功能化的伴刀豆球蛋白A的制备步骤为: 将0.25 g炭黑溶于50 mL 6 M硝酸中，超声I h后在130 °C条件下回流24 h，将上述溶液降到室温后离心并干燥，然后将产物溶于二次水后透析三天，得到石墨烯量子点，将800yL合成的石墨烯量子点和100 yL 2 mM的伴刀豆球蛋白A混合到10.0 mL水溶液中并在4 °C下反应过夜。
【文档编号】G01N27/327GK106018522SQ201610584489
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月25日
【发明人】葛慎光, 兰飞飞, 梁琳琳, 张彦, 李丽, 杨红梅, 任娜, 于京华, 颜梅
【申请人】济南大学