一套苹果、梨树枝条内外腐烂病菌组织学观测方法
【专利摘要】本发明公开了一套苹果、梨树枝条内外腐烂病菌组织学观测方法，涉及植物组织内病原菌观测领域。本方法适合观测新鲜或前期固定的样品，样品用切片机或徒手切片，厚度不超过100微米；组织切片用1%~15%的次氯酸钠溶液透明后，再用1%~30%氢氧化钾或氢氧化钠溶液浸泡3~5分钟，最后用0.1%~3%的苯胺蓝或甲基蓝水溶液染色1~3次，染色切片在荧光显微镜下用紫外光激发后，菌丝发黄绿色荧光。本发明的优点是：制片过程时间短，方法简便，不需要特殊设备和试剂；组织切片内的全部菌丝都能着色，与寄主组织反差明显，紫外光激发后清晰可见，克服了已有技术难以直观观测腐烂病菌潜伏菌丝、潜伏部位和整体分布的缺陷；为腐烂病的研究提供了一项新技术。
【专利说明】
一套苹果、梨树枝条内外腐烂病菌组织学观测方法
技术领域
[0001]本发明涉及植物组织内病原菌的观测技术，尤其适用于利用荧光显微境观察植物组织内病原菌的菌丝及其在组织内的寄生部位和分布。
【背景技术】
[0002]腐烂病是苹果和梨树的重要病害，主要造成死枝、死树和毁园。在苹果树上腐烂病是第一大病害，而且难以防治，被认为苹果树的“癌症”。自上世纪50年代，苹果树腐烂病在中国已大规模流行4次，几乎毁灭了建国以来新栽植的所有苹果树，目前正面临第五次大流行的威胁。腐烂病也是梨树上的重要病害，在西洋梨、新疆库尔勒梨等感病品种上危害严重。
[0003]腐烂病菌具有潜伏侵染现象。目前研究认为，腐烂病菌主要从剪锯口、伤口、皮孔、芽眼等部位侵染，病菌侵染后并不能马上致病，而是潜伏于伤口死组织、枝干表层死组织、木质部等部位，当树势衰弱，或者树体遭受冻害后，潜伏病菌才能扩展致病。病菌的潜伏侵染导致了腐烂病发病的不确定性，研究者难以根据病害的发生时间和发生程度推知病菌的侵染时间和某一时期的侵染量，从而制约腐烂病的研究。目前，对腐烂病的侵染规律、发病与流行条件、病菌的致病机制等的认识还十分有限，更难以提出防治腐烂病的有效措，因此，腐烂病一直是苹果树上的重要病害。
[0004]枝条内外腐烂病菌的观测技术是研究和认识腐烂病发生规律的关键性技术。如果能观测到潜伏在寄主组织内的腐烂病菌，就能通过人工接种等方法研究病菌的侵染条件、侵染部位和致病条件；了解病菌的潜伏部位和病菌的生长扩展动态；认识病菌在组织内潜伏原因和致病机制机制；评估所使用的杀菌剂对病害的防治效果。
[0005]传统的组织显微技术是目前观察组织内病菌的主要方法。传统的组织切片，如石蜡切片，主要借助苯胺蓝、甲基蓝、曲利苯蓝等染料，将植物组织内菌丝反染成蓝色，通过透射光源在显微镜下观察。然而，传统的染色方法特异性差，在显微镜下，难以分辩病菌菌丝和寄主组织，只能分辩形态特征明显的菌丝，更难以观测到菌丝的在组织内的整体分布情况，而且传统石蜡制片技术步骤繁琐，周期长，无法满足大量样品的观测需求。
[0006]超薄切片电镜观察也能观测到寄主组织内的腐烂病菌丝。超薄切片主要用于观察寄组织和菌丝的超微结构，对样品的要求高，切片制作过程复杂，而且需要透谢电子显微镜，一般的实验室条件难以完成，更不能用于大量样品的观测。
[0007]分子生物学技术检测也能检测寄主组织内是否存在腐烂病菌。分子生物学方法主要通过特异性探针，扩增寄主组织病菌的DNA片段，根据扩增DNA片段的有无，推断寄主组内是否存在腐烂病菌。分子生物学检测的最大缺陷是难以直观的观测病菌在寄主组织内的确切位置。
【发明内容】
[0008]针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一套用于直观观测苹果和梨树枝条内外腐烂病菌菌丝潜伏部位和整体分布的组织透明、染色和观察方法，为腐烂病发病规律、发病流行条件、致病机制、药效评估和田间病菌检测提供一套简洁和直观的观测技术。
[0009]本项发明采用的如下技术方案:用冷冻切片机或刀片对观测的样品材料切片，获得厚度不超过100微米的组织切片；用次氯酸钠对组织切片进行透明处理，以增加组织切片的透光率；组织切片透明后，再用强碱浸泡3~5分钟，目的是增加观测材料的对染料的渗透性，使组织内所有菌丝都能被染色剂染色；组织切片经强碱处理后再进行特异性荧光染色，使全部菌丝都能着色；制成的组织切片用紫外光激发菌丝内的染料，使染料发出黄绿色荧光，在显微镜下便可以清晰的观测组织切片内的所有菌丝。
[0010]制作组织切片和组织学观测的具体步聚如下:
(O取样:剪取新鲜的苹果或梨树枝条，切取待观测的部位，用刀片修成3~5毫米见方的组织块，直接用于切片；或转入固定液中保存，用于以后切片；
(2)切片:用冷冻切片机切片，或普通刀片徒手切片，获得厚度不超过100微米的组织切片；最佳切片厚度为10~20微米。将组织切片转入载玻片上，或小培养皿中，进行透明和染色；
(3)次氯酸钠透明:用滴管取含氯量1~15%次氯酸钠溶液2~3滴，滴加到组织切片上，对切片进行透明处理，直到切片完全透明为止。透明时间不宜过长。透明后用蒸馏水漂洗2-3次。透明时间为1~20分钟，透明时间依次氯酸钠的浓度、切片厚度、切片的质地确定。组织透明常用含氯量为10%的次氯酸钠溶液；
(4)强碱处理:用氢氧化钾或氢氧化钠配制1%~30%的水溶液，用滴管取强碱溶液滴加到组织切片上，浸泡3~5分钟，处理后用蒸馏水漂洗2~3次。常用强碱溶液的浓度为10% ;
(5)特色性染色:用苯胺蓝配制成0.1%~3%的水溶液，或者甲基蓝配制0.1%~5%水溶液作染色剂，用滴管取2~3滴染色剂滴加到组织切片上，染色3~5分钟，用蒸馏水漂洗I次，连续染色2~3次，直到染色液不再变为黄绿色为止。常用染色液为0.2%的苯胺蓝水溶液；
(6)制作临时玻片:用甘油配制成20%~80%的水溶液作浮载剂，将染色的组织切片转入载玻片上，摆放整剂，滴加1~2滴浮载剂，盖上盖玻片，制作临时玻片。常用浮载剂为50%的甘油水溶液；
(7)上镜观察:将临时玻片置于荧光显微镜下，用紫外光激发，紫外光波长范围315~400nm，使组织内菌丝能发出强烈黄绿色荧光，在显微镜下就能清晰观测到菌丝。
[0011]本发明的优点在于:应用本项发明技术在20~30分钟内就可以制作一套组织切片，不需要特殊的仪器或设备，徒手切片也能达到较为理想的效果，所用试剂都是实验室常规试剂。
[0012]应用实例之一，木要质部菌丝观测:取用腐烂病菌从新剪口接种富士苹果一年生枝条的木质部，3个月后取接种剪口下部2厘米的枝条，用冷冻切片机切成厚度30微米的组织切片；用氯含量为10%次氯酸钠透明5分钟，蒸馏水漂洗2次；用10%的氢氧化钾水溶液浸泡3分钟，蒸馏水漂洗2次；用0.2%苯胺蓝水溶液染色3次，每次2分钟；用50%甘油水溶液作浮载剂制作临时玻片；在荧光显微镜(莱卡DM2500)下用波长365 nm紫外光激发，在20倍的物镜能观测到组织切片内有大量发黄绿光的菌丝，菌丝结构明显，如图1和图2所示；在60倍物镜下，能清晰的观察到菌丝穿过导管生长扩展的形态结构，如图3所示。
[0013]应用实例之二，伤口死组织内菌丝观测:2014年9月份，用小钢锯将富士苹果I年生枝条锯伤，并立即喷孢子悬浮液接种，接种后用塑料膜保湿24小时；3个月后取接种过病菌的伤口切片观察，切片厚度50微米。透明、强碱处理、染色、制片和观察方法同应用实例一。在5倍物镜下，可以观测至接种伤口已形成木栓层，木栓层保护了活体皮层组织，木栓层隔离出的组织坏死，木栓层经紫外光激发后发出强烈的蓝色荧光，在显微微下清晰可见；栓皮层外的死组织发现的荧光很弱，但死组织内有大量菌丝，发出强烈黄绿色荧光，清晰可见，如图4所示；20倍的物镜下，可见到典型的菌丝结构，如图5所示。
[0014]【附图说明】:图1为20倍物镜下的染病苹果枝条木质部的纵切面，紫外光激发后，木质部内菌丝结构明显，发黄绿色荧光。图2为20倍物质下染病苹果枝条木质的横切面，导管内的菌丝结构明显，菌丝清晰可见。图3为60倍物镜下染病苹果枝条木质部内的菌丝，菌丝能从穿透导管壁进入另一个导管。图4为5倍物镜下的伤口，伤口龄期3个月，受伤时喷雾接种过腐烂病菌的孢子，该伤口已形成木栓层，紫外光激发后发现强烈的蓝色荧光，伤口死组织内的腐烂病菌丝发出黄绿色荧光。图5为20倍物镜下伤口死组织内的腐烂病菌菌丝，菌丝结构清晰可见，木栓层将死组织和活组织隔离。
【主权项】
1.一套苹果、梨树枝条内外腐烂病菌组织学观测方法，其特征在于:适合于观察新鲜和前期固定样品，具体过程包含切片、透明、强碱浸泡、染色、制片、上镜观察六个步骤； 所述新鲜样品为从苹果树或梨树剪取的新鲜枝条，切取待观测部位，修成3~5毫米见方的组织块； 所述前期固定样品为前期从苹果树或梨树上剪取枝条，切取待观测部位，修成3~5毫米见方组织块，置于固定液中固定保存的样品； 所述切片是对待观测的样品进行组织切片，组织切片可使用冷冻切片机切片，也可用普通刀片进行徒手切征，切片厚度不超过100微米；切片最佳厚度为10~20微米； 所述透明是在组织切片上滴加2~3滴透明液，处理3~10分钟，直到组织切片完全透明为止；组织透明可以在载玻片上进行，也可以在其他小容器中进行，透明液用次氯酸钠(NaClO3)配制，含氯量为1~15%，常用透明液含氯量为10%，组织透明后用蒸馏水漂洗2~3次； 所述强碱浸泡是在透明的组织切片上滴加2~3滴强碱水溶液，浸泡3~5分钟；强碱水溶液用氢氧化钾(KOH)或氢氧化钠(NaOH)配制，浓度为1%~30%，常用浓度为10% ;强碱浸泡后，用蒸馏水漂洗2~3次； 所述染色是在组织切片上滴加2~3滴苯胺蓝，或者甲基蓝染色液，染色2~3分钟，染色后用蒸馏水漂洗I次，共染色2~3次，直到染色液不再变色为止；苯胺蓝水溶液用苯胺蓝(Aniline blue)配制，浓度为0.1%~3%，常用浓度为0.2% ;甲基蓝水溶液用甲基蓝(Methylblue)配制，浓度为0.1%~5%，常用浓度为0.5% ;常用染色剂为0.2%苯胺蓝水溶液； 所述制片是将染色后的组织切片转入载玻片上，摆放整剂，滴加2~3滴甘油水溶液作浮载剂，制作临时玻片；甘油水溶液的浓度为20%~80%，常用浓度为50% ; 所述上镜观察是把制成的临时玻片，置于荧光显微镜下，用紫外光激发后，观察具有黄绿荧光的菌丝，紫外光的波长在315~400nm间。2.权利要求1所述的一套苹果、梨树枝条内外腐烂病菌组织学观测方法，其特征是:组织切片染色前，需经组织透明处理和强碱浸泡。
【文档编号】G01N21/64GK106033058SQ201510105934
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月11日
【发明人】李保华, 陈冲, 董向丽
【申请人】李保华, 青岛农业大学