一种蛋白定量检测方法
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，为解决目前蛋白的快速实时检测中ELISA等检测方法复杂耗时费试剂的缺点、电化学检测方法的非特异性吸附和界面修饰等缺点，本发明提出了一种蛋白定量检测方法，将待测蛋白样本、调节探针、扩增模板、切口酶、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、氯化镁、SYBR Green I荧光染料制成混合溶液，在等温条件下进行扩增反应，将待测蛋白浓度与等温扩增曲线的出峰时间之间建立定量关系，实现蛋白的实时定量检测。本方法具有简单、特异性高、通用性强和可以实时定量检测等优势，其检测限能达到亚纳摩尔级，可以满足一般的蛋白检测要求。
【专利说明】
一种蛋白定量检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种基于位阻效应的实时定量蛋白检测 方法。
【背景技术】
[0002] 近年来与疾病和癌症相关的蛋白标志物的研究越来越受到重视，对这些蛋白标志 物的检测在疾病诊断和临床医疗中具有十分重要的地位。目前临床上和实验室所采用的的 蛋白检测方法主要有:酶联免疫反应(ELISA)、We Stern blot、表面等离子共振技术(SPR)和 胶体金免疫试纸条等。这些检测方法虽然具有较高的检测灵敏度，但是也有操作步骤多、需 要多次清洗、耗费试剂量大和前处理过程复杂等缺点，整个分析过程通常需要几个小时甚 至更长，从而使得这些检测方法在实际应用上受到一定的限制。胶体金免疫试纸条技术虽 然简便易行，适合于现场快速检测，但是由于只能进行半定量分析、检测结果的稳定性较差 而且检测限较低，因此该检测方法不宜定量较低浓度的蛋白。
[0003] 相较于上述复杂的蛋白检测方法，一步均相检测法则具有较大的优势。一步均相 检测法将蛋白的特异性结合与信号的产生融合在均相溶液中，无需反复的洗涤和额外的试 剂添加。虽然一步均相检测法还达不到ELISA等方法的灵敏度，但是所需的检测时间和投入 的精力远远低于后者，这使得一步均相检测法在现场检测和高通量检测等实际应用中具有 一定的优势。在近期的一些研究中，大量的一步均相检测法被应用于蛋白检测中。这些方法 主要是基于以下几种策略：1)直接荧光调制检测，包括直接荧光检测、荧光偏振检测和基于 FRET技术的荧光检测；2)调节变构酶的活性检测，通过蛋白与变构酶的作用改变酶活性从 而改变信号的产生;3)调节超分子空间结构检测，通过蛋白将超分子相互作用的结构域分 开或拉近，从而产生相应的信号。在这些策略中，基于电化学检测的方法由于快速便携、试 剂耗量少、通用性强等优点而被广泛研究。但是电化学检测基于界面吸附这一特性使得检 测的特异性容易受到电极表面非特异性吸附的影响，另外，电极表面的修饰、前处理和保存 等也是其缺点。
【发明内容】
[0004] 为解决目前蛋白的快速实时检测中ELISA等检测方法复杂耗时费试剂的缺点、电 化学检测方法的非特异性吸附和界面修饰等缺点，本发明提出了一种蛋白定量检测方法， 具有简单、特异性高、通用性强和可以实时定量检测等优势，其检测限能达到亚纳摩尔级， 可以满足一股的蛋白检测要求。
[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：一种蛋白定量检测方法为将待测蛋白样本、 调节探针、扩增模板、切口酶、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、氯化镁、SYBR Green I荧光染料制 成混合溶液，在等温条件下进行扩增反应，将待测蛋白浓度与等温扩增曲线的出峰时间之 间建立定量关系，实现蛋白的实时定量检测。切口酶首先与调节探针中的切口酶识别序列 结合，当存在待测蛋白时，待测蛋白会立即与调节探针上的识别小分子特异性结合，由此所 产生的位阻效应将结合在该探针上的切口酶释放，释放的切口酶进而参与等温扩增反应， 从而实现对等温扩增速率的调节，将待测蛋白与等温扩增曲线的出峰时间之间建立定量关 系。
[0006] 作为优选，所述蛋白检测体系的终浓度组成为:0.01~5liM调节探针、0.01~5liM扩 增模板、0.1~10U切口酶、0.1~10U DNA聚合酶、1~10x缓冲液（10x的组成和浓度为1000mM NaCl、500mM Tris-HCl、1000yg/mL BSA)、0.1~ImM dNTPs、l~10mM氯化镁、0.05~lx SYBR Green I荧光染料。待测蛋白可与其他组份同时加入制成混合溶液或可以在其它组份制成 混合溶液后再加入待测蛋白。
[0007] 调节探针的结构为一条寡核苷酸链构成的茎环结构或由两条寡核苷酸链杂交形 成的复合结构，调节探针上修饰有待测蛋白的特异性识别小分子。
[0008] 茎环结构调节探针由茎、环、5'侧臂、3'侧臂、待测蛋白特异性识别小分子组成，茎 的一端与环连接，另一端分别与5'侧臂、3'侧臂连接，复合结构调节探针由茎、5'侧臂、3'侧 臂、待测蛋白特异性识别小分子组成，莖的一端分别与5'侧臂、3'侧臂连接，5'侧臂、3'侧臂 分别为单链侧臂。
[0009] 作为优选，调节探针的5'侧臂的碱基数目和3'侧臂的碱基数目至少有一个大于3。 调节探针的结构对调节探针结合切口酶的性能具有很大的影响，以保证切口酶与调节探针 之间的适当的结合力大小，进而调节扩增反应速率。
[0010] 调节探针的茎为双链，茎或茎环包含切口酶识别序列和非切口酶识别序列，切口 酶识别序列靠近两侧臂端。切口酶与调节探针中的识别序列相结合，待测蛋白与调节探针 中修饰的特异性识别小分子进行结合。
[0011] 调节探针上待测蛋白特异性识别小分子修饰在非切口酶识别序列上，修饰位置与 切口酶识别序列相距1-3个碱基。优选在紧邻切口酶识别序列的碱基上修饰。调节探针上识 别小分子修饰的位置对调节探针结合切口酶的性能具有很大的影响，否则结合在切口酶识 别序列上的调节探针无法有效结合切口酶，无法调节扩增反应的速率。本发明识别小分子 的修饰既不影响切口酶与探针的结合，又使得待测蛋白与调节探针结合后能和切口酶之间 产生最佳的有效位阻效应。
[0012] 茎环结构调节探针的环结构是单链结构，其核苷酸数目多0。
[0013] 扩增模板从3'到5'依次为结合序列、切口酶识别序列和扩增序列，其中扩增序列 和结合序列的一部分或全部完全相同。扩增反应可以使用与扩增模板的结合序列互补的引 物来触发，也可以仅仅依靠扩增模板的非特异性等温扩增来产生信号。
[0014] 所述切口 酶选自 Nt ? BstNBI、Nb ? BsrDI、Nb ? BtsI、N ? Alwl、Nt ? BsmAI、Nt ? BspQI 中一 种；
[0015]所述DNA聚合酶是具有链置换活性的核苷酸聚合酶。优选为Bst DNA聚合酶、Vent (exo_)聚合酶、Klenow DNA聚合酶。
[0016] 扩增反应的温度为30~80°C，优选反应温度为切口酶和DNA聚合酶发挥作用所对 应的最佳温度；
[0017] 本发明的检测方法的基本过程如下：
[0018] (1)待测蛋白通过和修饰在调节探针上的识别小分子特异性结合；
[0019] (2)由于特异性结合的待测蛋白所施加的位阻效应，使得结合在调节探针相应识 别位点上的切口酶与调节探针分离；
[0020] (3)因位阻效应与调节探针分离的切口酶被释放到溶液中，参与发生在扩增模板 上的等温扩增反应，扩增反应产生的荧光信号被实时监测，最终得到时间相关的信号曲线。
[0021] 在本发明中，我们利用位阻效应来调节溶液中相关酶的有效浓度，建立起待测蛋 白和酶催化信号之间的定量关系。本发明的DNA调节探针可以结合一种等温扩增反应所需 的酶，通过在调节探针上合适的位置引入待测蛋白的识别因子，就可以通过待测蛋白与调 节探针的特异性结合所产生的位阻效应将结合在该探针上的酶释放，从而调节溶液中作用 于等温扩增反应的游离酶的浓度，进而调节等温扩增信号的产生，建立起待测蛋白与等温 扩增信号之间的定量关系。本方法为一步均相检测方法，既克服了 ELISA等检测方法复杂耗 时费试剂的缺点，又没有电化学检测方法的非特异性吸附和界面修饰等缺点。另外，目前的 一步均相蛋白检测方法均为终点单点信号检测方式，使得其在快速高通量检测领域受到一 定的限制。本发明方法利用了等温扩增反应，将蛋白的检测模式从传统的终点定量模式转 变为实时定量模式(类似于Real-time PCR的检测模式），从而建立起待测蛋白浓度与等温 扩增曲线出峰时间之间的定量关系，使得本发明方法的优势更加明显。
[0022] 本发明只需要调整调节探针的结构并匹配所修饰的待测蛋白的识别小分子，即可 对任意目标蛋白进行定量检测。
[0023] 与现有技术相比，本发明的有益效果是:具有简单、特异性高、通用性强和可以实 时定量检测等优势，其检测限能达到亚纳摩尔级，可以满足一股的蛋白检测要求。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明所述调节探针的结构示意图；
[0025] 其中:A为茎环结构调节探针，B为复合结构调节探针；
[0026]图2为本发明所述蛋白检测方法的原理示意图；
[0027]图3(A)为实施例1中检测不同浓度梯度的亲和素存在时扩增反应的实时荧光定量 曲线；（B)为实施例1对应的亲和素浓度与出峰时间之间的定量曲线；
[0028]图4为对比例中本发明方法的检测特异性验证。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合说明附图，通过具体实施例对本发明进行说明。本领域的技术人员应当 理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0030] 本发明所述调节探针的结构示意图如图1所示，A为茎环结构调节探针，B为复合结 构调节探针。实施例选用茎环结构调节探针，其结构如图1 (A)所示，调节探针：
[0031] 5'-GCTCATCACTGCACTGACTCACGTTTTTCG(T-biotin)GAGTCAACTCCTGTAAG-3'（SEQ ID No. 1)(用识别小分子biotin修饰T碱基）；；
[0032]扩增模板：
[0033] 5'-CTCACGCTACGGACGACTCTCTCACGCTAC-3'（SEQ ID No.2)。
[0034]以亲和素作为待测蛋白。
[0035] 实施例1
[0036] (1)取5个EP管，各加入0.5yL调节探针P(浓度为lyM)、0.2yL切口酶Nt. BstNBI (浓 度为 10U/yL)，0.1yL Bst DNA聚合酶（浓度为8U/yL)，lyL dNTPs(浓度为 10mM)，4yL MgCl2 (浓度为25mM)，1.25yL lOxSYBR Green I，1.25yL扩增模板（浓度为1處）和11.7yL水，标号 Al、A2、A3、A4、A5 ;
[0037] (2)往六:管内加入2.5yL亲和素溶液(浓度为200nM);往六2管内加入2.5yL亲和素溶 液(浓度为150nM);往A3管内加入2.5yL亲和素溶液(浓度为100nM);往A4管内加入2.5yL亲和 素溶液(浓度为50nM);往As管内加入2.5yL水作为对照组。
[0038] (3)将上述5管溶液置于55°C温育，使反应充分进行并测定混合溶液的荧光随时间 的变化，采集时间间隔为1分钟。
[0039]实施例1对亲和素的检测灵敏度进行测定的扩增反应的实时荧光曲线结果如图3A 所示。由图3A可见，在测定不同浓度的亲和素时，调节探针存在时的扩增曲线的出峰时间随 着亲和素浓度的增大而显著缩短，表明亲和素和调节探针结合后与已结合在探针上的切口 酶之间的位阻效应能将切口酶有效释放到溶液中，且亲和素浓度越大，释放的切口酶越多， 扩增速率越快，扩增曲线出峰时间越短。因此能够将亲和素的浓度和扩增出峰时间之间建 立一种线性定量关系，该线性定量关系如图3B所示。
[0040] 在图3B中，横坐标为亲和素浓度，纵坐标为不同亲和素浓度下的出峰时间，该线性 曲线符合线性方程T = -0.53C+19.7，R2为0.99104,其中T表示扩增的S型曲线信号变化最大 处的时间，C表示亲和素浓度。由此可见本方法检测的线性较好，其检测限可达可达亚纳摩 尔级，与近期的其他一步均相蛋白检测法的灵敏度相似并有所提高。
[0041] 对比例
[0042] (1)取5个EP管，各加入0 ? 5yL调节探针（浓度为1虚）、0 ? 2yL切口酶Nt ? Bs tNBI (浓度 为 10U/yL)，0.1yL Bst DNA聚合酶(浓度为8U/yL)，lyL dNTPs(浓度为 10mM)，4yL MgCl2(浓 度为25mM)，1.25yL lOxSYBR Green I，1.25yL扩增模板（浓度为lyM)和 11.7yL水，标号Di、 D2、D3、D4、Ds〇
[0043] (2)往口:管内加入2.5yL亲和素溶液(浓度为200nM);往02管内加入2.5yL溶菌酶溶 液(浓度为200nM);往D3管内加入2.5yL弹性蛋白酶溶液(浓度为200nM);往D4管内加入2.5yL 免疫球蛋白溶液(浓度为200nM);往0 5管内加入2.5yL水作为对照组。
[0044] (3)将上述5管溶液置于55°C温育，使反应充分进行并测定混合溶液的荧光随时间 的变化，采集时间间隔为1分钟。
[0045] 对比例通过对亲和素的检测特异性进行测定的扩增反应的实时荧光曲线结果如 图4所示。由图4可见，其他3种蛋白的扩增反应的实时荧光曲线的出峰时间与对照组的接 近，且较亲和素的扩增曲线的出峰时间长很多，表明了本发明方法的高特异性。另外，反应 缓冲液中自身就已经存在了浓度很高的大蛋白BSA(66kDa，100yg/mL，相当于1500nM)，也说 明了该检测方法的高特异性。
【主权项】
1. 一种蛋白定量检测方法，其特征在于，所述的检测方法为将待测蛋白样本、调节探 针、扩增模板、切口酶、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、氯化镁、SYBR Green I荧光染料制成混合 溶液，在等温条件下进行扩增反应，将待测蛋白浓度与等温扩增曲线的出峰时间之间建立 定量关系，实现蛋白的实时定量检测。2. 根据权利要求1所述的一种蛋白定量检测方法，其特征在于，调节探针的结构为一条 寡核苷酸链构成的茎环结构或由两条寡核苷酸链杂交形成的复合结构，调节探针上修饰有 待测蛋白的特异性识别小分子。3. 根据权利要求2所述的一种蛋白定量检测方法，其特征在于，茎环结构调节探针由 茎、环、5'侧臂、3'侧臂、待测蛋白特异性识别小分子组成，茎的一端与环连接，另一端分别 与5'侧臂、3'侧臂连接，复合结构调节探针由茎、5'侧臂、3'侧臂、待测蛋白特异性识别小分 子组成，茎的一端分别与5 '侧臂、3 '侧臂连接。4. 根据权利要求3所述的一种蛋白定量检测方法，其特征在于，调节探针的5'侧臂的碱 基数目和3 '侧臂的碱基数目中一个或两个大于3。5. 根据权利要求3所述的一种蛋白定量检测方法，其特征在于，调节探针的茎或茎环包 含切口酶识别序列和非切口酶识别序列，切口酶识别序列靠近两侧臂端。6. 根据权利要求2或5所述的一种蛋白定量检测方法，其特征在于，调节探针上待测蛋 白特异性识别小分子修饰的非切口酶识别序列上，修饰位置与切口酶识别序列相距1-3个 喊基。7. 根据权利要求2或3所述的一种蛋白定量检测方法，其特征在于，茎环结构调节探针 的环结构是单链结构，其核苷酸数目多〇。8. 根据权利要求1所述的一种蛋白定量检测方法，其特征在于，扩增模板从3 '到5 '依次 为结合序列、切口酶识别序列和扩增序列，其中扩增序列和结合序列的一部分或全部完全 相同。9. 根据权利要求1所述的一种蛋白定量检测方法，其特征在于，所述切口酶选自 Nt · BstNBI、Nb · BsrDI、Nb · BtsI、N. Alwl、Nt · BsmAI、Nt · BspQI 中一种；所述 DNA 聚合酶是具有 链置换活性的核苷酸聚合酶。
【文档编号】G01N21/64GK106053403SQ201610279942
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】周建光, 吴望华, 张涛, 于东冬, 张胜锋, 袁振, 王昕然, 秦亚洲
【申请人】浙江大学