甘薯及其近缘属植物细胞中期分裂相标本快速制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种甘薯及其近缘属植物细胞中期分裂相标本快速制备方法，包括以下步骤：(1)取根尖2毫米；(2)解离：将根尖放入新配置的1.2mol/L的盐酸中，在55℃水浴锅中，得到解离后的根尖；(3)漂洗和后低渗：将解离后的根尖从解离液中取出，使用去离子水清洗两次，最后在去离子水中后低渗24分钟；(4)制片：将低渗后的根尖取出，置于载玻片上，经过处理后得到压片；(5)将所述压片置于光学显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行照相分析，用玻璃笔刀在盖玻片上标记，将标本放置于?80℃冰箱保存。本发明建立一套简单、高效、实用、经济的甘薯及其近缘属植物细胞中期分裂相标本制备方法，实现了在1小时内完成制片。
【专利说明】
甘薯及其近缘属植物细胞中期分裂相标本快速制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及植物细胞学研究技术，尤其涉及一种甘薯及其近缘属植物细胞中期分裂相标本快速制备方法。
【背景技术】
[0002]甘薯[Ipomoeabatatas(L.)Lam.，2n = 6x = _90]属旋花科(Convolvulaceae)甘薯属(Ipomoea)植物，原产于热带南美洲的秘鲁、厄瓜多尔和墨西哥一带，现广泛种植于世界热带、亚热带和温带地区。统计表明，甘薯在全世界超过110个国家都有种植，其中，我国的甘薯种植面积约占全世界的65.4%，产量约占全世界的85.9%。甘薯兼具粮经作物的特点，是我国乃至世界上重要的粮食、饲料和工业原料作物。其富含淀粉、矿质元素、纤维素和β-胡萝卜素以及多种维生素，被誉称为“蔬菜皇后”。
[0003 ]甘薯染色体组成复杂，染色体基数为15，栽培种基本为6Χ，其近缘属有2Χ、4Χ、6Χ三种倍性，某些种不只一种倍性。其染色体小，数量多，细胞质浓厚、染色能力弱，较难获得清晰干净的染色体制片，细胞遗传学水平的研究发展较慢，严重滞后于小麦、玉米、水稻等作物。目前研究主要集中在染色体数目与减数分裂行为的观察上，对甘薯多倍体的染色体组成和结构研究较少。对于甘薯的起源与进化至今仍不明确，栽培甘薯是同源多倍体、异源多倍体还是同源异源多倍体一直存在争议。目前存在几种不同的假说，各假说都缺少足够的实验证据。随着近年来甘薯基础研究以及育种研究工作的不断深入，迫切需要在细胞水平对甘薯进行更加深入的研究，进一步明确甘薯起源及进化，促进甘薯基础研究和遗传育种的发展。
[0004]目前虽然已有关于甘薯及其近缘属细胞学研究的相关报道，但是这些研究广泛使用的中期分裂相制备方法仍然存在一些不足，主要包括:(I)使用8-羟基喹啉、对二氯苯饱和水溶液、秋水仙素等预处理根尖，富集中期分裂相，需要时间长；(2)—般预处理药品对人体危害较大；(3)处理后的分裂中期细胞数量虽然较不处理有所增加，但增加数量仍然有限；(4)必须固定12-24小时，制备过程繁琐，人工成本较高；(5)使用纤维素酶和果胶酶解离根尖，处理时间长，且很难掌握解离程度；(6)需通过长时间大量练习才能制出较好标本。
【发明内容】
[0005]本发明是为了解决上述不足，提供了一种甘薯及其近缘属植物细胞中期分裂相标本快速制备方法。
[0006]本发明的上述目的通过以下的技术方案来实现:
[0007]针对目前甘薯及其近缘属植物细胞学研究中中期分裂相标本制备存在的问题，本发明研究得到了简便快速获得含有大量细胞中期分裂相标本的方法，以高效性、实用性和可操作性等为特点，提供了一整套完整的甘薯及其近缘属植物中期分裂相标本制备的技术方法，实现了在I小时内完成制片，并得到大量甘薯及其近缘属植物的中期分裂相。
[0008]—种甘薯及其近缘属植物细胞中期分裂相标本快速制备方法，其特征在于:包括以下步骤:
[0009](I)取根尖:取材时间直接决定本实验的实验效果，也是本发明最核心的步骤，必须严格控制在中午12:20到中午1:00之间，选取生长旺盛的新生根，使用消毒解剖刀切取根尖2毫米左右；
[0010](2)解离:将根尖放入新配置的1.2mo 1/L的盐酸中，在55°C水浴锅中，严格计时，水浴18分钟后取出，得到解离后的根尖；
[0011](3)漂洗和后低渗:将解离后的根尖从解离液中取出，使用去离子水清洗两次，最后在去离子水中后低渗24分钟；
[0012](4)制片:将低渗后的根尖取出，置于载玻片上，用干净的解剖刀片去掉根尖的最前端根冠区约0.5-0.8毫米，解剖针捣碎根尖，滴约15微升吉姆萨染液，染色5-8分钟后，盖上盖玻片，盖玻片的一侧用大拇指和食指固定，用铅笔轻轻敲击盖玻片，去除气泡，使组织成为一薄层，然后在酒精灯的火焰上烘烤至微热，在所述盖玻片上加一吸水纸，用拇指挤压所述盖玻片使细胞充分分散，得到压片；
[0013](5)将所述压片置于光学显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行照相分析，用玻璃笔刀在盖玻片上标记，将标本放置于-80 V冰箱保存。
[0014]本发明与现有技术相比的优点是:本发明建立一套简单、高效、实用、经济的甘薯及其近缘属植物细胞中期分裂相标本制备方法，快速获得大量细胞中期分裂相标本，为甘薯及其近缘属植物细胞学研究和远缘杂交育种工作提供支持，实现了在I小时内完成制片，并得到大量甘薯及其近缘属植物的中期分裂相。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例对本发明进一步详述。
[0016]实施例1:甘薯品种川薯20细胞中期分裂相标本制备的具体操作方法如下:
[0017](I)材料准备:选择无虫眼和病斑的饱满的甘薯品种川薯20的薯块，使用75%酒精消毒8分钟，用无菌蒸馏水冲洗三次。冲洗完后，将薯块置于装有蒸馏水的塑料盆中在25°C培养箱中培养，中途注意观察，如水分不足，迅速加水；
[0018](2)取根尖:等块根培养一周后，长出大量根后，取根尖。取根尖时间直接决定本实验的实验效果，必须严格控制在中午12:20到中午1:00之间，选取生长旺盛的新生根，使用消毒解剖刀切取根尖2毫米左右；
[0019](3)解离:将根尖放入新配置的1.2mol/L的盐酸中，在55°C水浴锅中，严格计时，水浴18分钟后取出，得到解离后的根尖；
[0020](4)漂洗和后低渗:将解离后的根尖从解离液中取出，使用去离子水清洗两次，最后在去离子水中后低渗24分钟；
[0021](5)制片:将低渗后的根尖取出，置于载玻片上，用干净的解剖刀片去掉根尖的最前端根冠区约0.5-0.8毫米，解剖针捣碎根尖，滴约15微升吉姆萨染液，染色5-8分钟后，盖上盖玻片，盖玻片的一侧用大拇指和食指固定，用铅笔轻轻敲击盖玻片，去除气泡，使组织成为一薄层，然后在酒精灯的火焰上烘烤至微热，在所述盖玻片上加一吸水纸，用拇指挤压所述盖玻片使细胞充分分散，得到压片；
[0022](6)将所述压片置于光学显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行照相分析，用玻璃笔刀在盖玻片上标记，将标本放置于-80 V冰箱保存。
[0023]实施例2:甘薯近缘属1.triloba(2X)细胞中期分裂相标本制备的具体操作方法如下:
[0024](I)材料准备:选择无虫眼和病斑的饱满的甘薯近缘属1.triloba(2X)的种子，在超净工作台上使用75%酒精消毒8分钟，再放入12%的次氯酸钠溶液中消毒6分钟，最后无菌蒸馏水冲洗三次。冲洗完后，使用消毒后的解剖刀切掉1-2毫米种皮。待种皮去除干净后，待种皮去除干净后，将种子置于垫有2层滤纸的消毒培养中，加入4-8毫升去离子水，然后将培养皿置于28°C培养箱中进行培养，中途注意观察，如水分不足，迅速加水；
[0025](2)取根尖:等块根培养一周后，长出大量根后，取根尖。取根尖时间直接决定本实验的实验效果，必须严格控制在中午12:20到中午1:00之间，选取生长旺盛的新生根，使用消毒解剖刀切取根尖2毫米左右；
[0026](3)解离:将根尖放入新配置的1.2mol/L的盐酸中，在55°C水浴锅中，严格计时，水浴18分钟后取出，得到解离后的根尖；
[0027](4)漂洗和后低渗:将解离后的根尖从解离液中取出，使用去离子水清洗两次，最后在去离子水中后低渗24分钟；
[0028](5)制片:将低渗后的根尖取出，置于载玻片上，用干净的解剖刀片去掉根尖的最前端根冠区约0.5-0.8毫米，解剖针捣碎根尖，滴约15微升吉姆萨染液，染色5-8分钟后，盖上盖玻片，盖玻片的一侧用大拇指和食指固定，用铅笔轻轻敲击盖玻片，去除气泡，使组织成为一薄层，然后在酒精灯的火焰上烘烤至微热，在所述盖玻片上加一吸水纸，用拇指挤压所述盖玻片使细胞充分分散，得到压片；
[0029](6)将所述压片置于光学显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行照相分析，用玻璃笔刀在盖玻片上标记，将标本放置于-80 V冰箱保存。
[0030]以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及实施例内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1.一种甘薯及其近缘属植物细胞中期分裂相标本快速制备方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)取根尖:在中午12:20到中午1:00之间，选取生长旺盛的新生根，使用消毒解剖刀切取根尖2晕米； (2)解离:将根尖放入新配置的1.2mol/L的盐酸中，在55°C水浴锅中，严格计时，水浴18分钟后取出，得到解离后的根尖； (3)漂洗和后低渗:将解离后的根尖从解离液中取出，使用去离子水清洗两次，最后在去离子水中后低渗24分钟； (4)制片:将低渗后的根尖取出，置于载玻片上，用干净的解剖刀片去掉根尖的最前端根冠区0.5-0.8毫米，解剖针捣碎根尖，滴15微升吉姆萨染液，染色5-8分钟后，盖上盖玻片，盖玻片的一侧用大拇指和食指固定，用铅笔轻轻敲击盖玻片，去除气泡，使组织成为一薄层，然后在酒精灯的火焰上烘烤至微热，在所述盖玻片上加一吸水纸，用拇指挤压所述盖玻片使细胞充分分散，得到压片； (5)将所述压片置于光学显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行照相分析，用玻璃笔刀在盖玻片上标记，将标本放置于-80 V冰箱保存。
【文档编号】G01N1/30GK106092677SQ201610377477
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】冯俊彦, 蒲志刚, 张洁, 李明, 张聪, 屈会娟, 阎文昭, 谭文芳, 杨松涛, 王大, 王大一
【申请人】四川省农业科学院生物技术核技术研究所