利用鱼的erod检测水体污染的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用鱼的7?乙氧基异吩恶唑酮脱乙基酶(EROD)检测水体污染的方法。本方法通过获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的EROD作为敏感生物标记物，实现检测待测水体的污染。本方法利用鱼的EROD作为敏感生物标记物，可敏感地监测菲污染的污染程度和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。
【专利说明】
利用鱼的EROD检测水体污染的方法
技术领域
[0001]本发明涉及利用生物敏感标志物检测水体污染，更具体地说，本发明涉及一种利用鱼的EROD含量检测水体污染程度的方法。
【背景技术】
[0002]随着城镇化和工农业的迅猛发展，水体污染日益加剧。水域中的水体污染物也各有不同，有的为单一污染物，也有多种污染物混合污染。对于未知水域中，不管是单一污染物的污染，还是多种污染物的污染，怎样获悉水体是否被污染，甚至知道其污染程度，并能直观判断该水域的污染对生物的危害已达到何种程度。对于水体中受到多环芳烃菲污染时，用化学方法可以定性、定量检测到污染，但是无法检测其危害性和危害程度以及污染程度的准确性。
【发明内容】
[0003]本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
[0004]本发明还有一个目的就是提供一种利用鱼的EROD检测水体污染的方法，本方法利用鱼的EROD作为敏感生物标记物，可敏感地监测菲污染的污染程度和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。
[0005]为了实现根据本发明的这些目的和其他优点，提供了一种利用鱼的EROD检测水体污染的方法。本检测方法为获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的EROD作为敏感生物标记物。其中，EROD是7-乙氧基异吩恶唑酮脱乙基酶的简写。
[0006]优选的是，所述鱼的EROD含量与水体中菲的浓度呈正相关。
[0007]优选的是，建立鱼的EROD含量与污染物浓度关系的标准曲线，然后将待检测水域中的同种同大小的所述鱼的EROD含量与所述标准曲线比对，得到待检测水域中水体污染物浓度。
[0008]优选的是，所述标准曲线为鱼的EROD含量与菲浓度关系的曲线。
[0009]优选的是，所述鱼的EROD含量通过鱼7-乙氧基异吩恶唑酮脱乙基酶ELISA试剂盒测定。
[0010]优选的是，所述鱼为海水青鏘或淡水青鏘。
[0011]本发明至少包括以下有益效果:本发明以水域中鱼的EROD作为敏感生物标记物，通过对比EROD含量就可以检测出水体是否受到污染，不但检测准确和敏感，而且直观反映该水域的污染对生物的危害程度。特别是鱼的EROD含量与水体中菲的浓度呈正相关，所以检测到鱼的EROD含量越高，其的水域受污染的程度越大，并且明示受到菲的污染。通过建立鱼的EROD含量与菲浓度的标准曲线可以将待检测水域中与建立标准曲线同种同大小的鱼的ER0D含量比对，获得水域中菲浓度大小，并且能反映出目前的污染程度对生物是否在安全范围或受到危害。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书能够据以实施。
[0013]实施例1
[0014]本方案利用鱼的EROD含量检测水体污染程度的方法，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的EROD作为敏感生物标记物，通过检测鱼的EROD含量，然后比对同类同大小的鱼的EROD含量与某污染物浓度关系的标准曲线，就可以检测出水体是否受到某污染物的污染，不但检测准确，且敏感度高，而且能直观反映该水域的某污染物的污染程度及其对生物的危害程度。其中，EROD是7-乙氧基异吩恶唑酮脱乙基酶的简写。
[0015]实施例2
[0016]本方案利用鱼的EROD含量检测水体污染程度的方法，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的EROD作为敏感生物标记物，根据鱼的EROD含量与水体中菲的浓度呈正相关，通过测定鱼的EROD含量，然后比对同类同大小的鱼的EROD含量与菲浓度的标准曲线，如果检测样本鱼的EROD含量比正常情况下的同类同大小的鱼的EROD含量高，则判断水域受到菲的污染;如果比正常情况下的同类同大小的鱼的EROD含量越高，则判断水域的菲污染越严重，甚至可判断是否达到危害水体生物的程度。
[0017]实施例3
[0018]本方案利用鱼的EROD含量检测水体污染程度的方法，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的EROD作为敏感生物标记物。首先通过实验建立鱼的EROD含量与某污染物浓度关系的标准曲线，然后将待检测水域中的同种同大小的鱼的EROD含量与所述标准曲线比对，得到待检测水域中某污染物的浓度。再次提示，取需要检测的水域中的鱼与建立标准曲线的鱼是同类同大小的鱼。
[0019]通过实验建立鱼的EROD含量与菲浓度关系的标准曲线如下:
[0020]本实验的检测样本以海水青鏘为例，分5组每组3个平行在下述各组镉浓度养鱼实验，结束时每个平行取3尾鱼样品测定，每组测定3x3 = 9个数据，将每组9个数据数理统计后得到每组鱼的EROD含量大小。各组镉浓度分别为O，250，500，750，1000yg/L，养殖条件是盐度30土2，水温为28±2°C，pH为8.10,溶氧量彡6.10mg/L，光暗比为14h:1Oh，各组实验操作均相同。每天投喂饲料三次，总投喂量为投喂时鱼体湿重的5%。每天仔细观察和记录仔稚鱼活动、摄食、畸形、死亡等，并跟踪检测水体和鱼体菲的变化，7天后随机采集鱼样品，分别称重，存于-80°C冰箱中(暂存待测)，样品采用鱼的组织匀浆，通过鱼7-乙氧基异吩恶唑酮脱乙基酶ELI SA试剂盒测定。测定并经数理统计的的各组EROD含量分别是:1.174、3.533、4.307、6.610、7.901ng/ml。海水青鏘的EROD含量与水体中菲的浓度呈正相关，然后根据实验结果绘制标准曲线。
[0021]通过鱼7-乙氧基异吩恶唑酮脱乙基酶ELISA试剂盒测定海水青鏘的EROD含量，样品采用鱼的组织匀浆，具体步骤如下:
[0022](I)标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分另Il加900pg/ml原倍标准品ΙΟΟμΙ，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μ1，混匀;然后从第一孔、第二孔中各取100μ1分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μ1，混匀;然后在第三孔和第四孔中各取50μ1弃掉，再在第三孔和第四孔中各取50μ1分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50μ1分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μ1，混匀后从第七、第八孔中分别取50μ1加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μ1，混匀后从第九第十孔中各取50μ1弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μ1，浓度分别为600pg/mL，400pg/mL，200pg/mL，100pg/mL，50pg/mL)；
[0023](2)加样:空白孔:空白对照孔不加样品，生物素标记的抗-EROD抗体，链霉亲和素-HRP，只加显色剂A&B和终止液，其余各步操作相同;标准品孔:加入标准品50μ1，链霉素-HRP50μ1，因标准品中已事先整合好生物素抗体，故不加抗-EROD抗体;待测样品孔:加入样本40μ?，然后各加入抗-EROD抗体?ομ?、链酶亲和素-HRP 50μ1，盖上封板膜，轻轻振荡混匀
[0024](3)温育:用封板膜封板后置37°C温育60分钟；
[0025](4)配液:将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用；
[0026](5)洗涤:小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
[0027](6)显色:每孔先加入显色剂A 50μ1，再加入显色剂B 50μ1，轻轻震荡混匀，37°C避光显色10分钟；
[0028](7)终止:每孔加终止液50μ1，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
[0029](8)测定:以空白对照调零，450nm波长依序测量各孔的光密度(0D值)，测定应在加终止液后15分钟以内进行；
[0030](9)以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出参考曲线，根据样品的OD值由参考曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数10，即为样品的浓度，也就是海水青鏘的EROD含量。
[0031]然后将计算得海水青鏘的EROD含量大小与标准曲线比对，不但可以知道水体是否受到污染，而且从标准曲线中可以知道水体中菲浓度的大小，更能知道水体对生物体危害程度。
[0032]实施例4
[0033 ]利用实验可以建立任何水体任何鱼种的鱼的EROD含量与菲浓度关系的标准曲线，然后取待测水域中的鱼做样本，只要做样本的鱼与建立标准曲线的鱼是同类同大小的即可进行比对。
[0034]通过鱼7-乙氧基异吩恶唑酮脱乙基酶ELISA试剂盒测定鱼的EROD含量，所用试剂盒可以是南京生物工程研究所生产的试剂盒，OD值可以用荧光分光光度计测定，样品可以是鱼的体液、血清、血浆、细胞培养上清液、尿液、组织匀浆、心房水等，本实施方案采用鱼的血浆，具体步骤如下:
[0035](I)标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照试剂盒的说明在小试管中进行稀释；
[0036](2)加样:空白孔:空白对照孔不加样品，生物素标记的抗-EROD抗体，链霉亲和素-HRP，只加显色剂A&B和终止液，其余各步操作相同;标准品孔:加入标准品50μ1，链霉素-HRP50μ1，因标准品中已事先整合好生物素抗体，故不加抗-EROD抗体;待测样品孔:加入样本40μ?，然后各加入抗-EROD抗体?ομ?、链酶亲和素-HRP 50μ1，盖上封板膜，轻轻振荡混匀
[0037](3)温育:用封板膜封板后置37°C温育60分钟；
[0038](4)配液:将30 (48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 (48T的20倍)倍稀释后备用；
[0039](5)洗涤:小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
[0040](6)显色:每孔先加入显色剂A 50μ1，再加入显色剂B 50μ1，轻轻震荡混匀，37°C避光显色1分钟；(7)终止:每孔加终止液50μ1，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
[0041 ] (8)测定:以空白对照调零，450nm波长依序测量各孔的光密度(0D值)，测定应在加终止液后1分钟以内进行；
[0042](9)以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出参考曲线，根据样品的OD值由参考曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数10，即为样品的浓度，也就是海水青鏘的EROD浓度。
[0043]将计算得鱼的EROD含量大小与标准曲线比对，不但可以知道水体是否受污染，而且从标准曲线中可以知道水体中菲浓度的大小，更能知道水体对生物体危害程度。
[0044]实施例5
[0045]利用实验建立20日龄的淡水青鏘的EROD含量与菲浓度关系的标准曲线，然后取待测水域中的鱼做样本，只要取得样本的鱼与建立标准曲线的鱼是同类同大小的即可进行比对。
[0046]取得待测水域中20日龄的淡水青鏘做样本，然后通过鱼7-乙氧基异吩恶唑酮脱乙基酶ELISA试剂盒测定淡水青鏘的EROD含量，样品采用鱼的血浆，可以用南京生物工程研究所生产的试剂盒、荧光分光光度计或UV/VIS分光光度计，具体步骤如下:
[0047](I)标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分另Il加900pg/ml原倍标准品ΙΟΟμΙ，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μ1，混匀;然后从第一孔、第二孔中各取ΙΟΟμΙ分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μ1，混匀;然后在第三孔和第四孔中各取50μ1弃掉，再在第三孔和第四孔中各取50μ1分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50μ1分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μ1，混匀后从第七、第八孔中分别取50μ1加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μ1，混匀后从第九第十孔中各取50μ1弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μ1，浓度分别为600pg/mL，400pg/mL，200pg/mL，100pg/mL，50pg/mL)；
[0048](2)加样:空白孔:空白对照孔不加样品，生物素标记的抗-EROD抗体，链霉亲和素-HRP，只加显色剂A&B和终止液，其余各步操作相同;标准品孔:加入标准品50μ1，链霉素-HRP50μ1，因标准品中已事先整合好生物素抗体，故不加抗-EROD抗体;待测样品孔:加入样本40μ?，然后各加入抗-EROD抗体?ομ?、链酶亲和素-HRP50yl，盖上封板膜，轻轻振荡混匀
[0049](3)温育:用封板膜封板后置37°C温育60分钟；
[0050](4)配液:将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用；[0051 ] (5)洗涤:小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
[0052](6)显色:每孔先加入显色剂A 50μ1，再加入显色剂B 50μ1，轻轻震荡混匀，37°C避光显色10分钟；
[0053](7)终止:每孔加终止液50μ1，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
[0054](8)测定:用荧光分光光度计或UV/VIS分光光度计，以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的OD值，测定应在加终止液后10分钟以内进行；
[0055](9)以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出参考曲线，根据样品的OD值由参考曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数10，即为样品的浓度，也就是淡水青鏘的EROD浓度。
[0056](10)以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出参考曲线，根据样品的OD值由参考曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数10，得到样品的浓度为2.335ng/ml，也就是淡水青鏘的EROD含量。乘以的稀释倍数是根据操作过程中实际稀释的倍数确定的。
[0057]将计算得鱼的EROD含量大小分别和EROD含量与菲浓度的标准曲线比对，得到待测水域的菲污染浓度为130yg/L，这样既可以知道水体已受到污染，而且从标准曲线中可以知道水体中菲浓度的大小，更能知道水体对生物体危害程度。
[0058]尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列应用范例，它完全适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地另行修改他用，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
【主权项】
1.一种利用鱼的EROD检测水体污染的方法，其特征在于，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的EROD作为敏感生物标记物。2.根据权利要求1所述的利用鱼的EROD检测水体污染的方法，其特征在于，所述鱼的EROD含量与水体中菲的浓度呈正相关。3.根据权利要求1-2任一项所述的利用鱼的EROD检测水体污染的方法，其特征在于，建立鱼的EROD含量与污染物浓度关系的标准曲线，然后将待检测水域中的同种同大小的所述鱼的EROD含量与所述标准曲线比对，得到待检测水域中水体污染物浓度。4.根据权利要求3所述的利用鱼的EROD检测水体污染的方法，其特征在于，所述标准曲线为鱼的EROD含量与菲浓度关系的曲线。5.根据权利要求4所述的利用鱼的EROD检测水体污染的方法，其特征在于，所述鱼的EROD含量通过鱼7-乙氧基异吩恶唑酮脱乙基酶ELISA试剂盒测定。6.根据权利要求4所述的利用鱼的EROD检测水体污染的方法，其特征在于，所述鱼为海水青鏘或淡水青鏘。
【文档编号】G01N33/18GK106093332SQ201610546258
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】许友卿, 丁兆坤, 刘阳, 李云杰, 刘富娟
【申请人】广西大学